如何實施對檢測實驗室檢驗能力的確認

文/倪敏 喻雨琴

實驗室是用于在科學上為闡明某一現象而創(chuàng)造特定的條件以便觀察其變化和結果的機構。檢測實驗室則是用于完成檢測工作的實驗室，向社會提供準確可靠的檢測數據和結果，它在技術經濟活動和社會發(fā)展過程中都占有重要的地位。檢測實驗室終產品的體現是檢測報告，實驗室要向社會出具高質量的報告，并得到社會各界的信賴和認可，所以其檢測數據的可靠性至關重要。

實驗室是否通過檢查并提供客觀證據，證實某一特定預期用途的特定要求得到滿足？實驗室是否對非標準方法、實驗室設計（制定）的方法、超出其預定范圍使用的標準方法、擴充和修改過的標準方法進行確認，以證實該方法適合于預期的用途?CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》提出了方法的確認。

確認的定義：通過檢查并提供客觀證據以證實某一特定的預期用途的特殊要求或應用要求已得到滿足的認定。確認應盡可能的廣泛全面，以滿足預定用途或應用領域的需要，證實實驗室能夠正確地執(zhí)行標準方法。實驗室是否記錄所獲得的結果、使用的確認程序以及該方法是否適于預期用途的聲明？這就要求檢測實驗室在開始檢測之前應確認能夠正確地運用標準方法；當標準的方法發(fā)生了變化，應重新進行確認，以證實實驗室能夠正確地執(zhí)行變化了的標準方法。

一般實驗室應對4種檢測方法進行確認，以證實這些方法適用于預期用途，包括：標準方法應用實施前；非標準方法；自己新設計開發(fā)；超過預期范圍使用的標準方法/擴充和修改過的標準方法。方法確認的前提是驗證，驗證則是一個持續(xù)的過程。

確認是運行前和變化后實施的評定，目的在于證明各檢測/驗方法能力能夠達到預期的控制水平（或滿足可接受水平）；驗證是在運行中和運行后進行的評定，目的在于證明確實達到了預期的控制水平（和/或滿足了可接受水平）。

一、檢測方法確認的技術要求說明

目前對檢測方法在使用前或變更后的確認可依據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F對技術要素進行驗證。

1.回收率

回收率是向試樣中加入已知量被測組分的標準物質，最后看加入已知量的標準物質是否能定量回收，以判斷分析過程是否存在系統(tǒng)誤差。在樣品中加入標準物質，測定其回收率，可以檢驗分析方法的準確程度和樣品所引起的干擾誤差。

對于食品中的禁用物質，回收率應在方法測定低限、2倍方法測定低限和10倍方法測定低限進行三水平試驗；對于已制定最高殘留限量（MRL）的，回收率應在方法測定低限、MRL、選一合適點進行三水平試驗；對于未制定MRL的，回收率應在方法測定低限、常見限量指標、選一合適點進行三水平試驗?；厥章实膮⒖挤秶姳?：

表1 回收率范圍

回收率公式：

回收率（%）=（添加標準物質的試樣實測量-試樣中被測物量）/加入標準物質量×100%---（1）

2.校準曲線

①被測組分濃度的選擇

應描述校準曲線的數學方程以及校準曲線的工作范圍，濃度范圍盡可能覆蓋一個數量級（如0.1～1.0），至少作5個點（不包括空白），在不同濃度水平上畫出一條標準曲線。對于篩選方法，線性回歸方程的相關系數不應低于0.98；對于確證方法，相關系數不應低于0.99。測試溶液中被測組分濃度應該在校準曲線的線性范圍內。

對于給出良好線性度方法，用測量標準在5個不同濃度水平上畫出一條標準曲線即可。當線性度差時，需要更多個測量標準。定量分析方法的線性都是通過分析具有覆蓋方法所要求濃度范圍的分析物樣品來確定，應用最小二乘法將其結果用于計算回歸線。如果某一檢測方法在一特定范圍內是線性的（但不是絕對要求），這就比較理想。

標準曲線回歸方程：

y=a+bx -------------------------（2）

相關系數R=0.9999

式（2）中：a——截距；

b——斜率。

在分析測試中常會遇到處理兩個變量之間的關系，如在建立校準曲線時需要了解被測組分的濃度和響應值之間的關系。兩個變量x與y之間的關系存在著函數關系，y值隨著x值按照確定的規(guī)律變化，由一個xi值可以精確地求出yi值。

（x,y）的散布圖 y=f(x)------------（3）

回歸函數是一個線性函數，則稱變量間是線性相關的。一元線性回歸方程：y=a+bx

由于存在測定誤差，x與y不是函數關系，而是相關關系（相關關系是統(tǒng)計關系）。

②校準曲線的繪制注意事項

每種應用校準曲線的分析方法在初次使用時，可通過繪制校準曲線以確定它的檢測上限，并結合檢測下限確定其檢測范圍。繪制校準曲線應注意：

a校準曲線一般可根據4～6個濃度及其測量信號響應值繪制；

b測量信號值的最小分度應與縱坐標的最小分格相適應；

c濃度的整數值應落在橫坐標的中格或大格的粗線上，以便于分小格查閱，并盡量使校準曲線的幾何斜率接近于1（與橫坐標約成45°角），以使在兩個軸上的讀數誤差相近。

d校準曲線的斜率常因溫度、試劑批號等條件的變化而變化。在測定未知樣品的同時測繪校準曲線是最理想的。否則，應在測定未知樣品的同時，平行測定線性范圍內的中等濃度標準溶液和空白溶液各2份，取均值相減后，與以前繪制的校準曲線上相同點進行核對，二者的相對差值根據方法精密度要求小于5%或小于10%，否則應重新繪制校準曲線。

③校準曲線的相關因素

繪制校準曲線所依據兩個變量的線性關系，決定著校準曲線的質量和樣品測定結果的準確度。影響校準曲線線性關系的因素：

a分析方法本身的精密度；

b分析儀器的精密度；

c量取標準溶液所用量器的準確度；

d易揮發(fā)溶劑（如萃取反應顯色物的有機溶劑）揮發(fā)所造成比色液體體積的變動幅度；

e分析人員的操作水平。

由于存在測定誤差，可用“相關系數”來判斷校準曲線的線性關系。如用4～6個濃度的標準溶液及其測量響應值繪制的校準曲線，根據實驗經驗應力求其相關系數的絕對值IrI≥0.999。否則可參照上述影響線性關系的諸因素，找出原因并盡可能加以糾正，重新測定和繪制新的校準曲線。

對于成熟的分析方法和熟練的分析人員若能細心并嚴格按規(guī)范操作，則校準曲線的相關系數絕對值IrI≥0.999，在實驗條件不變情況下校準曲線的斜率一般很穩(wěn)定，其截距等于零。

④相關系數檢驗法檢驗

方程y=a+bx中因變量y與自變量x之間是否確實存在相關關系，在求線性回歸方程的過程中也可用最小二乘法求得“回歸方程”，畫出一條直線，這可用相關系數檢驗法檢驗。相關系數的顯著檢驗具體步驟如下：

a按照公式（4）由樣本值計算相關系數r

b給定顯著性水平α，按照樣本容量n，由“相關系數臨界值表”（見“回歸分析”中的“相關系數臨界值表”）中查出臨界值rα,n。

c 比較IrI與rα,n的大小，若IrI≥rα,n，則認為x與y之間存在線性相關關系；若IrI

例：用原子吸收分光光度法測定微量鈷，得到下列一組數據（見表2）：

表2 用原子吸收分光光度法測定微量鈷

試由上述數據確定A與c的線性回歸方程式，該關系式是否有意義？

解：分別求出斜率b和截距a

按下式計算出相關系數：r=Sxy/（SxxXSyy）1/2=1.000

查相關系數臨界值表，r0.05,5=0.878，r>r0.05,5，說明確立的回歸方程是有意義的。

3.精密度

精密度就是幾次平行測定（分析）結果相互接近的程度。精密度的高低用偏差來衡量。其中偏差是指單次測定結果值與幾次測定結果平均值之間的差別。

①偏差的計算

對于食品中的禁用物質，精密度實驗應在方法測定低限、2倍方法測定低限和10倍方法測定低限三個水平進行；

對于已制定MRL（最高殘留限量）的，精密度實驗應在方法測定低限、MRL、選一合適點三個水平進行；對于未制定MRL的，精密度實驗應在方法測定低限、常見限量指標、選一合適點三個水平進行。

復測定次數至少為6。實驗室內部的變異系數參考范圍見表3。

表3 實驗室內變異系數

絕對偏差=單次測得值-測得結果平均值

相對偏差=絕對偏差/測得平均值×100%

平均偏差：各次測量值偏差的絕對值之和被測量次數除的平均值。

相對平均偏差：平均偏差/平均結果x 100%

極差：也稱全距R，是一組數據極大值與極小值之差。

目前普遍采用標準差的相對值來反映數據的相對波動度，標準差的相對值稱為相對標準偏差RD。

單次測量結果的相對標準偏差又稱變異系數CV。

例：測定試樣中的氟化物含量，重復測定5次，其數據為：

0.45；0.39；0.47；0.40；0.43 mg/L，試求極差？平均偏差？標準差？變異系數？

計算結果：極差R=0.47-0.39=0.08 mg/L

平均偏差d=I0.13I/5=0.026 mg/L

標準差S=0.00451/2/(5-1)=0.033 mg/L

變異系數CV=0.033/0.43x100%=7.7%

②標準差的作用

a表示觀察值分布的離散程度（由偶然誤差決定）。當兩組觀察值在單位相同、兩均數相近的條件下，標準差較大，說明觀察值的變異程度較大，即觀察值圍繞均數的分布較離散，均數的代表性較差；反之均數的代表性就較好。

在理化檢驗工作中，例如摸索某一檢驗方法的實驗條件或比較兩種檢測方法時，都常用到標準差。

b用標準差計算變異系數。當兩組觀察值單位不同，或兩均數相差較大時，不能直接用標準差比較其變異程度的大小，這時可用變異系數（CV）進行比較。

同標準差一樣，變異系數愈小，說明觀察值的變異程度愈??；變異系數愈大，說明觀察值的變異程度愈大。理化檢驗方法的精密度就是用變異系數28 ssm ／2010／5（或稱相對標準差）表示的。

重復性試驗：目的是為了預測精密度。

平行測定的次數愈多，其平均值愈接近真實值。合理的反映實驗室對一個分析方法的精密度應該通過在一個時間階段（1～2周）內若干批的試驗中得到，這樣可以區(qū)分出批內和批間的變異而指出產生隨機誤差的重要來源。另一方面從所有批的批內標準差合并值可以指出常規(guī)分析中隨機誤差的規(guī)律。

在實驗設計中必須選擇合適的批數m和重復測量次數n，一般情況下n=2～4次，m=5～10次為最合適。

4.測定低限

①測定方法

方法的測定低限按公式（9）計算：

式中：CL－方法的測定低限；

Sb－空白值標準偏差（一般平行測定20次得到）；

b－方法校準曲線的斜率。

對于已制定MRL（最高殘留限量）的物質，方法測定低限加上樣品在MRL處標準偏差的3倍，不應超過MRL值。對于禁用物質，方法測定低限應盡可能低。

測定低限又稱檢出限或檢測限：把3倍空白值的標準偏差（測定次數n≥20）相對應的質量或濃度稱為測定低限（檢出限）。如色譜法：設色譜儀最低響應值和檢出限分別按公式（10）和（11）計算：

式中：N為儀器噪音水平。

式中：b-標準曲線回歸方程中的斜率；

響應值 /μg或響應值 /ng；

S-儀器噪音的3倍，即儀器能辨認的最小物質信號。

②測定低限（又稱檢出限或檢測下限）分類

測定低限可分為三類：

a儀器檢測下限：即相當于背景，儀器檢測的可靠最小信號，通常用信號噪聲比表示，當N/S≥3時，定義為儀器檢測下限；

b方法檢測下限:即某方法可檢測的最小濃度。

方法的測定低限（檢測下限）按公式（9）計算；標準偏差按公式（12）計算：

標準曲線回歸方程按公式（2）計算。

c樣品檢測下限:即相對于空白可檢測的最小樣品的含量。定義樣品檢測下限為3倍空白標準偏差即3S空白，故而只有空白含量為零時，樣品檢測下限才等于方法檢測下限，然而空白含量往往不等于零。

5.準確度

準確度——表示分析結果與真實值接近的程度。

重復分析標準物質（實物標樣）或水平測試樣品，測定含量（經回收率校準后）平均值與真實值的偏差指導范圍（見表3）。

表3 測定值與真實值的偏差指導范圍

分析結果和真實值之間的差值稱為誤差，誤差越小分析結果的準確度越高；誤差越大分析結果的準確度越低。

準確度的高低用誤差來衡量。

誤差分為：

絕對誤差——測定值與真實值之間的差值；

相對誤差——測定值與真實值之間的差值對真實值的百分數。

例如：某物質的真實值為1.0000g，測定值為0.9980g，

其絕對誤差為-0.0020g；

其相對誤差=（-0.0020/1.0000）×100%=-0.2%。

將測得的組分的百分含量與公認的“真實值”之差，作為定量分析的誤差，以衡量某一分析方法或某一實驗室的分析水平，或衡量某一分析者的技術熟練程度。

相對誤差是誤差在真實值中所占的百分率：

相對誤差=（絕對誤差/被測量真實值）×100%。

6.提取效率

提取效率可用以下方法進行試驗：

① 用陽性的標準物質或水平測試的陽性樣品進行試驗；

②陽性樣品用同一溶劑反復提取，觀察被分析物的濃度變化；

③用不同提取技術或不同提取溶劑進行比較。

提取效率與樣品的前處理、選擇的溶劑、提取技術有關：由于食品本身（如蛋白質、脂肪、糖類等）對分析測定常產生干擾，因此在定性定量分析測定之前必須對樣品進行前處理。樣品在處理過程中，既要排除干擾的因素，又不致于使被測物受到損失，而且還應能使被測物達到一定濃度，從而使測定得到理想結果。所以在分析過程中，樣品的前處理、選擇的溶劑、提取技術是分析測定的重要步驟。在分析化學中，常用的分離方法有沉淀分離法、液-液萃取分離法、離子交換分離法、色譜分離法、蒸餾和揮發(fā)分離法等。

如液-液萃取分離又叫溶劑萃取分離，一般簡稱萃取分離。這種方法是利用與水不相混的有機溶劑同試液一起震蕩，這時，一些組分進入有機相中，另一些組分仍留在水相中，從而達到分離的目的。提取效率直接影響到檢測回收率、精密度、準確度、線性范圍和最低檢出限。

7.特異性（定性要求）

對于檢測篩選方法和確證方法特異性必應予以規(guī)定，尤其對于確證方法必應盡可能清楚地提供待測物的化學結構信息，特別是一些化學官能團、分子結構僅基于色譜分析而沒有使用分子光譜測定的方法，不能用于確證方法。確證方法可采用：

①氣相色譜-質譜；

②液相色譜-質譜；

③免疫親和色譜或氣相色譜-質譜；

④氣相色譜-紅外光譜；

⑤液相色譜-免疫層析。

筆者曾見一檢測實驗室在驗證確認其新研究的檢測方法時僅用分光光度法，當介紹到分光光度計在兩個不同波長處分別出現有兩個峰時，實驗人員以“峰形漂亮對稱”為理由認為這就是要確定選擇的具特異性化合物的峰，但該實驗室并未采用其他的方法作佐證進行定性，這是沒有科學依據的確證方法。因此策劃采用不同的儀器作為確證方法，可以清楚地提供待測物的化學結構信息，特別是一些化學官能團、分子結構，可確保有效地進行定性。

8.耐用性

檢測方法應具有對可變試驗因素的抗干擾能力，當測定條件發(fā)生細小變動時，方法應具有一定的保持測定結果不受影響的承受程度。

耐用性也稱抗變性或穩(wěn)健性。不同實驗室在使用同一檢測方法時，他們不可避免地會在程序方法上引入一些小的變動，這些變動可能會也可能不會對方法的工作特點產生重大影響。一種方法的耐用性（抗變性或穩(wěn)健性）是通過慎重地對檢測方法引入某些小的改變并檢查其影響結果來測試的。用同一樣品由三個以上實驗室按同樣檢測方法檢驗，該檢測方法應具有一定的保持測定結果不受影響的承受程度。

再現性（復現性）—表示不同分析人員或不同實驗室之間在各自實驗條件下所得分析結果的精密度。一個數值R在再現性條件下，兩次測試結果的絕對差值不超過此數R的概率為一個指定值（一般為95%）。所謂再現性條件是指在兩個不同實驗室，不同操作人員，不同儀器設備，在不同或相同的時間內，用同樣試驗方法程序對同一被試樣品所得的兩個獨立單次試驗結果的再現試驗條件。也可理解為在改變了的測量條件下，同一被測量結果之間的一致性。

確認研究新的檢測方法，其研究必須要提供有按7特異性和8耐用性兩個技術要素指標的數據。綜合了上述8個技術參數驗證數據才能確認該檢測方法預期目的有效性。

如：首次采用的標準檢測方法在應用于樣品檢測前，應對檢測方法的技術要素進行驗證確認。

二、實驗室擬擴項標準檢測方法

首次采用的標準方法在應用于樣品檢測前，應對檢測方法的技術要素進行驗證試驗，再實施確認。如某檢測實驗室要擴SC/T 3025-2006《水產品中甲醛的測定》檢測方法，該方法適用范圍：適用于水產品中甲醛含量的定量測定。

1.策劃

①立項申請：目的、人員、儀器設備及試劑、時間安排及進度；

②計劃任務書：人員、時間安排及進度、策劃驗證項目、判定值、評價、確認的方法；

③驗證工作的實施；

④評價和確認。

2.實驗人員遵循技術要素開展

①回收率

“對于食品中的禁用物質，回收率應在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進行三水平試驗。”

根據NY 5172-2002《無公害食品水發(fā)水產品》規(guī)定，甲醛為食品中的禁用物質，其最高殘留限量（MRL）≤10.0mg/kg。

由此三個添加回收率水平是

a.方法測定低限0.5mg/kg；

b.MRL 10.0mg/kg；

c.MRL與方法測定低限間合適點5.00mg/kg。

按SC/T 3025-2006《水產品中甲醛的測定》檢測方法4.1.5.1對甲醛標準儲備液的標定，甲醛標準溶液的濃度是5.004mg/L；

計算得：a XL1-1=0.450mg/kg；XL1-2=0.456mg/kg；

按照標準GB 27404-2008附錄F.1回收率規(guī)定：被測組分含量在0.1mg/kg～1mg/kg，其回收率范圍80%～110%；1.0mg/kg～100mg/kg其回收率范圍90%～110%。故本項目回收率符合標準要求。

②校準曲線

曲線Y=0.0171X-0.0018 R=0.9999

按照標準GB 27404-2008附錄F.2校正曲線要求，相關系數R>0.98，故本項目能滿足標準的要求。

③精密度

同回收率部分進行三水平試驗，每個水平重復6次，對變異系數進行考查。

三水平試驗 L1 L2 L3 0.450 4.56 9.450.456 4.55 9.330.444 4.60 9.260.474 4.49 9.240.468 4.54 9.430.456 4.60 9.42 CV（%） 2.44 0.91 0.84樣品（mg/kg）

按GB 27404-2008附錄F.3精密度的要求：

被測組分含量范圍在 1mg/kg 10mg/kg 10mg/kg

變異系數應 <11%<7.5% <7.5%

故本項目能滿足標準的要求。

④測定低限

方法的測定低限按公式（9）計算：

CL＝3Sb/b

對于已制定MRL的物質，方法測定低限加上樣品在MRL處，標準偏差的3倍，不應超過MRL值。對于禁用物質，方法測定低限應盡可能低。

平均測定20次空白，其吸光度為：0.0010，0.0012，0.0012，0.0008，0.0009，0.0011，0.0010，0.0012，0.0008， 0.0012， 0.0014， 0.0008， 0.0011， 0.0013，0.0012，0.0010，0.0009，0.0007，0.0010，0.0009

標準偏差（n=20） Sb=0.000190，標準曲線斜率=0.0171

CL=3Sb/b=3×0.000190/0.0171=0.0333mg/kg

當取樣量為10g，稀釋倍數為10，標樣與樣品比色體積都為10mL時，CL=0.0333×10=0.333mg/kg，

低于SC/T 3025-2006《水產品中甲醛的測定》中（4.1）檢出限0.50mg/kg的要求，故能滿足最低檢出限的要求。

⑤準確度

取陰性樣品添加甲醛標準溶液，添加量為10.008mg/kg；

取平均樣測定： m1=10.00g m2=10.00g

甲醛標準溶液濃度為 5.004mg/L

A1=0.0151、A2=0.0152

測定值與真實值之間的差值對真實值的百分數

（|9.91-10.008|/10.008）×100%=0.98% <15%

按照標準GB 27404-2008附錄F.5準確度的要求，故本項目能滿足標準的要求。

⑥提取效率

取甲醛標準溶液按照標準方法處理，收集蒸餾液，取10.0mL進行比色反應，上儀器讀吸光度；另取甲醛標準溶液2.00mL，稀釋至10.0mL進行比色反應，上儀器讀吸光度，得：未經蒸餾提取甲醛標準溶液的吸光度:

A 0.1688 X 9.93mg/kg

經蒸餾提取甲醛標準溶液的吸光度：

A 0.0151 X 9.88mg/kg

經蒸餾提取后的殘液，再次蒸餾提取甲醛測得吸光度：

A 0.0003 X 1.2mg/kg

在蒸餾提取處理過程中第一次收集了約99.5%，約0.5%的甲醛在第二次蒸餾提取處理中收集到。該方法提取效率本實驗能滿足要求。

三、結論

通過對以上技術要素的驗證，實驗室可以確認該檢測方法能達到預期使用的效果。由實驗室技術負責人批準該檢測方法列入實驗室的擴項申請。