1,6-二磷酸果糖預(yù)處理對(duì)家兔急性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用＊

劉行海 買(mǎi)文麗 劉紅 鄭倩 敬華娥 易志剛

(1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科,四川 南充 637000)

腎缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)損傷導(dǎo)致的急性腎功能衰竭在臨床上具有很高的發(fā)病率和死亡率。因此,如何減輕或避免腎缺血-再灌注損傷一直是臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。1,6-二磷酸果糖(FDP)作為糖酵解中高能中間代謝產(chǎn)物,近年研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心臟、腦、小腸等器官的缺血再灌注損傷有較好的防治效果[1-3],但關(guān)于FDP在腎I/R損傷方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立兔腎缺血60min再灌注180min致腎I/R損傷模型,探討FDP對(duì)兔急性I/R損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 FDP由山東新華制藥股份有限公司提供,產(chǎn)品批號(hào)：0906030。血尿肌酐、尿素氮、SOD和 MDA測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程有限公司提供產(chǎn)品批號(hào)：20091020。

1.2 動(dòng)物分組及術(shù)前處理 健康雄性新西蘭大白兔27只,本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,6月齡,體質(zhì)量2.5±0.28kg,雌雄不拘,隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I組)和1,6-二磷酸果糖預(yù)處理組(F組),每組9只,置空調(diào)室常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)前4d每天1次,F組于耳緣靜脈緩慢輸注1,6-二磷酸果糖(用生理鹽水稀釋成每ml含F(xiàn)DP為50mg,100mg?kg-1)。S組和I組均僅用2ml?kg-1生理鹽水。

1.3 腎臟缺血再灌注模型的復(fù)制 1%戊巴比妥鈉溶液(3ml?kg-1,iv),麻醉兔。腹中線(xiàn)切口,去左腎。分離右腎動(dòng)、靜脈并夾閉,60min后恢復(fù)灌流,觀察腎臟顏色變化,確定血流5min之內(nèi)恢復(fù),關(guān)閉腹腔再灌注180min時(shí)取右腎。假手術(shù)組開(kāi)腹后僅行左腎切除,右腎蒂游離。

1.4 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo) 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)心臟取血,測(cè)定血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Cr)含量。右腎標(biāo)本用4℃冷生理鹽水沖洗去血液,剪下腎下極組織濾紙吸干,隨即稱(chēng)取0.5g加4℃生理鹽水4.5ml,用玻璃勻漿器制成10%的組織勻漿,采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,以 TBA比色法測(cè)定MDA含量。同時(shí)摘取部分右腎組織置于10%中性甲醛溶液中固定24h后常規(guī)石蠟包埋,按病理學(xué)常規(guī)制片HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理變化和腎小管評(píng)分。根據(jù)Jablonski等[4]制定的腎臟近曲小管壞死程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為5級(jí)：0級(jí)為正常;1級(jí)為單個(gè)細(xì)胞的壞死伴核分裂;2級(jí)為相鄰近曲小管所有細(xì)胞的壞死,但周?chē)」艽婊?3級(jí)為限定于近曲小管遠(yuǎn)端1/3細(xì)胞的壞死并擴(kuò)展到皮質(zhì)和髓質(zhì)交界處;4級(jí)近曲小管整段壞死。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以表示,采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟功能的測(cè)定 與S組比較,I組和F組血清Cr、BUN水平均升高(P＜0.05),而 F組低于 I組(P＜0.01),見(jiàn)表1。

表1 血清中Scr、BUN含量的變化(±s,n=9)

表1 血清中Scr、BUN含量的變化(±s,n=9)

＊P＜0.05 vs S group;#P＜0.01 vs I group.

group Scr(μ mol? L-1) BUN(mmol?L-1)S 59.09±15.08 6.48±1.27163.36±19.21＊ 16.24±3.23＊F 112.06±8.15＊# 9.76±0.73＊#I

2.2 腎組織MDA含量、SOD活性的變化 與S組比較,I組和F組再灌注后腎組織SOD活性均降低、MDA含量均升高(P＜0.01);而 F組SOD、MDA分別高于和低于 I組(P＜0.05),見(jiàn)表2。

2.3 腎組織病理學(xué)改變 光鏡下觀察：S組兔腎組織結(jié)構(gòu)基本正常;I組大部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)程度較重的腫脹及不同程度壞死,腎間質(zhì)局部出血水腫及明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);F組僅見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹,少量變性與壞死,腎間質(zhì)局部輕度出血水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。F組腎小管計(jì)分明顯低于I組(P＜0.05),見(jiàn)表3。

表2 腎組織中SOD活性、MDA含量的變化(±s,n=9)

表2 腎組織中SOD活性、MDA含量的變化(±s,n=9)

＊P＜0.01 vs S group;#P＜0.05 vs I group.

group SOD(U?mg-1) MDA(nmol?mg-1)S 240.02±10.91 3.14±0.63145.90±10.26＊ 5.88±2.38＊F 177.93±22.77＊# 3.91±1.17＊#I

表3 腎小管計(jì)分的變化±s,n=5)

表3 腎小管計(jì)分的變化±s,n=5)

＊P＜0.05 vs S group;#P＜0.05 vs I group.

group n scores of tubules S 50.24±0.323.12±0.53＊F 51.45±0.44＊#I 5

3 討論

缺血-再灌注損傷是缺血性急性腎功能衰竭的重要損傷環(huán)節(jié),也是腎移植中影響移植腎早期功能恢復(fù)的主要因素。現(xiàn)已公認(rèn)腎臟I/R損傷與活性氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)[5]。FDP作為糖酵解的中間產(chǎn)物,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其對(duì)心臟、腦、小腸、肝等組織器官缺血再灌注損傷有較好的保護(hù)作用。研究表明FDP可保護(hù)心肌的SOD活性,增強(qiáng)心肌清除超氧陰離子的能力,從而減少心肌細(xì)胞生成過(guò)氧亞硝酸陰離子[6]。Markov等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FDP通過(guò)激活人、犬的嗜中性白細(xì)胞,抑制超氧陰離子O-2和H2O2的產(chǎn)生,提示FDP本身具有與超氧化歧化酶(SOD)相似的抗氧化作用[7]。

在腎臟I/R損傷過(guò)程中,腎臟在黃嘌呤氧化酶的催化下,由次黃嘌呤生成尿酸的過(guò)程中及中性粒細(xì)胞等作用下產(chǎn)生大量的活性氧自由基。氧自由基具有很強(qiáng)的生物活性,通過(guò)與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物,其水平增高時(shí),可引起明顯的細(xì)胞或組織損傷;SOD是自由基的重要清除酶之一,可減輕脂質(zhì)過(guò)氧化,對(duì)組織或細(xì)胞具有保護(hù)作用。因此如若組織中的SOD活性增加,M DA含量減少就可以反映對(duì)缺血再灌注臟器的保護(hù)作用。本研究中根據(jù)人和動(dòng)物之間的劑量換算關(guān)系,采用FDP劑量為100mg?kg-1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注180min,經(jīng) FDP預(yù)處理后腎組織SOD與模型I組相比,SOD活性升高,M DA含量明顯降低,同時(shí) F組BUN、Cr升高輕于I組(P＜0.01)。光鏡下可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹,變性和壞死程度均較I組明顯減輕,腎小管評(píng)分也明顯低于I組(P＜0.05)。表明FDP可通過(guò)提高SOD活性,減輕缺血-再灌注中氧自由基介導(dǎo)的組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),這可能是減輕腎缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

綜上所述,FDP對(duì)腎缺血再灌注后的腎臟具有保護(hù)作用,部分是通過(guò)提高超氧化物歧化酶活性,減少氧自由基生成來(lái)發(fā)揮作用,至于FDP的保護(hù)機(jī)制和使用的最佳時(shí)機(jī)及濃度等有待進(jìn)一步研究。

1 劉福林,周玉娟,白杰,等.1,6-二磷酸果糖預(yù)處理對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)會(huì)通訊,2000,1：57-58.

2 史曉峰,劉敦貴.1.6-二磷酸果糖在大鼠小腸缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志,2003,11(4)：278-280.

3 曾凡新,董志.周螋新,等.果糖二磷酸鈉鎂對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥房,2003,14(10)：593-595.

4 Jablonski P,Howden BO,Rae DA,et al.An experimental model for assessment of renal recovery f rom warm ischemia[J].Transplantation,1983,35(3)：198-204.

5 Wmk da,Mitchell JB.Chemical biology of nitric oxide：insights into regulatory,cytotoxic,and and cytoprotective mechanisms of nitric oxide[J].Free Radical Biology and Medicine,1998,25(4-5)：434-456.

6 陽(yáng)冠明,李樹(shù)全,葉司原,等.1,6-二磷酸果糖對(duì)阿霉素導(dǎo)致大鼠酪氨酸硝基化的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào),2002,18(2)：161-165.

7 Markov AK,Rayburn TS.Fructose-1,6-diphosphate alone and in combination with cyclosporine potentiatesrat cardiac allograft survival and inhibits ly mphocyte proliferationand interleukin-2 ex pression[J].T ransplantation,2002,74(11)：1651-1654.