13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工藝研究

張麗雅,楊維成,羅 勇

(上海化工研究院,上海 200062)

近年來(lái),不法商販以提高蛋白質(zhì)檢測(cè)數(shù)值為目的,向飼料和奶制品中非法添加三聚氰胺、三聚氰酸等含氮量高的化工原料,造成了嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題,并引發(fā)了世界范圍內(nèi)對(duì)中國(guó)造食品安全的信任危機(jī)。因此,針對(duì)奶制品和其他食品檢測(cè)三聚氰胺和三聚氰酸含量是當(dāng)前食品安全的重要任務(wù)之一。

三聚氰胺、三聚氰酸的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有以下三類:①反相液相色譜法,檢測(cè)限通常達(dá)2μg/g[1];②氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,檢測(cè)食品中三聚氰胺最低報(bào)告水平是10 ng/g[2];③液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,檢測(cè)靈敏度通常達(dá)到 ng/g水平。在采用同位素稀釋質(zhì)譜法(Isotope Dilution Mass Spectrometry,IDMS)后,三聚氰胺定量限達(dá)到0.1 ng/g[3]。

IDMS是采用與被測(cè)物質(zhì)具有相同分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性同位素(15N、13C、2H等)標(biāo)記的化合物作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),用高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)質(zhì)譜儀測(cè)量相應(yīng)質(zhì)量數(shù)的離子的m/z并與標(biāo)準(zhǔn)的m/z進(jìn)行比較達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的。

利用同位素稀釋質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的三聚氰胺、三聚氰酸,同位素內(nèi)標(biāo)試劑三聚氰胺、三聚氰酸是不可或缺的工具。目前,尚無(wú)文獻(xiàn)公開(kāi)報(bào)道同位素標(biāo)記三聚氰胺、三聚氰酸的合成方法,市售的同位素標(biāo)記三聚氰胺、三聚氰酸均被跨國(guó)公司壟斷。開(kāi)展同位素標(biāo)記三聚氰胺、三聚氰酸的合成研究工作有利于打破國(guó)外壟斷,完善我國(guó)食品安全檢測(cè)技術(shù)體系,滿足我國(guó)食品安全發(fā)展的需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Nicolet 6700紅外吸收光譜儀:美國(guó)尼高力公司產(chǎn)品;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司產(chǎn)品;240C元素分析儀:美國(guó)珀金埃爾默公司產(chǎn)品;TSQ Quantum Access液質(zhì)聯(lián)用儀:美國(guó)熱電公司產(chǎn)品;MAT-271氣體同位素質(zhì)譜計(jì):美國(guó)菲尼根公司產(chǎn)品;不銹鋼反應(yīng)釜:上海化工研究院設(shè)計(jì)制造,耐壓20 kg,帶有溫控系統(tǒng)。

1.2 主要材料與試劑

15N-氯化銨、13C-尿素:分析純,上海化工研究院產(chǎn)品;二氧六環(huán)、氨水、環(huán)丁砜、二苯醚、DMF、硝基苯:分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;乙腈:色譜純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;丙酮:分析純,上海試劑一廠產(chǎn)品;三聚氰氯:分析純,百靈威公司產(chǎn)品;醋酸銨、庚烷磺酸鈉:色譜純,上海安譜公司產(chǎn)品;檸檬酸:分析純,上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 三聚氰酸的合成[4-7]及分析

三聚氰酸的合成路線示于圖 1。將 5 g(0.083 mol)尿素、8 mL環(huán)丁砜加入三口燒瓶中,攪拌加熱至120℃,開(kāi)啟真空泵將體系壓力降至0.013 MPa,繼續(xù)升溫至回流,保持1～2 h。冷卻后,對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾、水洗,得到三聚氰酸白色晶體。

圖1 三聚氰酸的合成路線

分別采用美國(guó)Themo Fisher Scientific公司的 Accela高效液相色譜儀和美國(guó)Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)所得三聚氰酸進(jìn)行定性和定量分析。

色譜分析:三聚氰酸晶體用乙腈溶解,過(guò)0.45μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。色譜條件:采用Hypersil Gold柱(150 mm ×4.6 mm,5μm)作為固定相;V(乙腈)∶V(甲酸水溶液)=95∶5為流動(dòng)相,等梯度洗脫,流速為0.4 mL/min,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

質(zhì)譜分析:采用電噴霧(ESI)離子源,負(fù)離子模式,噴霧電壓 3 000 V、鞘氣 30 arb、輔助氣5 arb、毛細(xì)管溫度 350 ℃、Q1分辨率 0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。

1.4 三聚氰胺的合成[8-13]及分析

三聚氰胺的合成路線示于圖2。將7.38 g(0.04 mol)三聚氰氯、40 mL二氧六環(huán)加入到反應(yīng)釜中,于0～5℃下加入含0.24 mol NH 3的氨水,密封反應(yīng)器,升溫至140℃,反應(yīng)4 h。冷卻后,抽濾、水洗、重結(jié)晶得到三聚氰胺白色晶體。

分別采用日本島津公司的LC-20AT高效液相色譜儀和美國(guó)Themo Fisher Scientific公司的TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)所得三聚氰酸進(jìn)行定性和定量分析。

色譜分析:用50%乙腈水溶液溶解三聚氰胺,過(guò)0.45μm濾膜后進(jìn)行質(zhì)譜分析。色譜條件:采用 Venusil ASB C18柱(46 mm×150 mm)作為固定相;V(檸檬酸庚烷磺酸鈉溶液)∶V(乙腈)=92∶8作為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm;流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜分析:采用電噴霧(ESI)離子源。三聚氰酸采用負(fù)離子模式,噴霧電壓3 000 V、鞘氣30 arb、輔助氣5 arb、毛細(xì)管溫度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。三聚氰胺采用正離子模式,噴霧電壓 4 500 V、鞘氣38 arb、輔助氣8 arb、毛細(xì)管溫度350 ℃、Q1分辨率0.7 u、掃描范圍m/z=30～150。

圖2 三聚氰胺的合成路線

2 結(jié)果與討論

2.1 13C3-三聚氰酸的合成結(jié)果

合成三聚氰酸化學(xué)反應(yīng)式如下:

由以上化學(xué)反應(yīng)可知,尿素經(jīng)反應(yīng)(1)發(fā)生裂解反應(yīng),此過(guò)程較慢;經(jīng)反應(yīng)(3)聚合生成三聚氰酸是自發(fā)反應(yīng),反應(yīng)(1)生成的氨氣若不能及時(shí)被移走,反應(yīng)(4)就會(huì)大量發(fā)生。反應(yīng)(1)和反應(yīng)(2)是平行反應(yīng),在溫度低時(shí)反應(yīng)(2)更容易發(fā)生,但是當(dāng)溫度升高時(shí),縮二脲會(huì)發(fā)生分解。

2.1.1 溶劑對(duì)三聚氰酸收率的影響

由合成三聚氰酸反應(yīng)過(guò)程可知,升高溫度有利于生成的縮二脲分解,促進(jìn)縮合反應(yīng)進(jìn)行。選擇合適的高沸點(diǎn)溶劑,適當(dāng)提高反應(yīng)溫度有利于反應(yīng)進(jìn)行,但常壓下回流,反應(yīng)溫度過(guò)高,溶劑在其常壓沸點(diǎn)附近會(huì)分解,發(fā)生不期望的副反應(yīng)。選用高沸點(diǎn)溶劑環(huán)丁砜(285℃)、二苯醚(255 ℃)、DMF(155 ℃)、硝基苯(210 ℃)等作為反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行溫度條件實(shí)驗(yàn),同時(shí)調(diào)整反應(yīng)體系的壓力控制回流溫度,結(jié)果列于表1。由表1可知,采用環(huán)丁砜作為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)可獲得良好收率,二苯醚和硝基苯次之,DMF最低;適當(dāng)保持系統(tǒng)負(fù)壓(0.013 MPa),降低溶劑的回流溫度,可以得到更好的收率。表1顯示,以環(huán)丁砜為溶劑,保持系統(tǒng)負(fù)壓0.013 MPa,反應(yīng)的回流溫度控制為205℃,三聚氰酸的收率最高,達(dá)83%。

2.1.2 壓力對(duì)三聚氰酸收率的影響

以環(huán)丁砜作為反應(yīng)介質(zhì),其與尿素的比例不變,只改變反應(yīng)體系壓力,其他反應(yīng)條件按1.3節(jié)進(jìn)行,結(jié)果列于表2。分析表2可知,通過(guò)保持系統(tǒng)適度負(fù)壓,將反應(yīng)產(chǎn)生的氨氣及時(shí)除去,有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物三聚氰酸的收率。在一定范圍內(nèi),三聚氰酸的產(chǎn)率隨體系壓力增大而增大,當(dāng)反應(yīng)壓力為0.013 MPa與0.019 MPa時(shí),反應(yīng)收率達(dá)到最大。這主要是由于環(huán)丁砜的回流溫度隨體系壓力增大而升高,溫度升高有助于減少副產(chǎn)物縮二脲的生成,從而提高三聚氰酸收率。但是隨著系統(tǒng)壓力進(jìn)一步升高到0.024 MPa時(shí),產(chǎn)品呈現(xiàn)黃色,這可能是回流溫度過(guò)高,加速了環(huán)丁砜分解所致。因此,優(yōu)選反應(yīng)壓力為0.013～0.019 MPa。

表1 溶劑對(duì)三聚氰酸合成收率的影響

表2 壓力對(duì)三聚氰酸收率的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)三聚氰酸收率的影響

1.3 節(jié)中,其他條件不變,僅改變反應(yīng)時(shí)間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3。由表3可知,隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),產(chǎn)品收率上升,并在1.5 h時(shí)達(dá)到較高收率;隨著反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),產(chǎn)品收率趨于恒定。表明,反應(yīng)進(jìn)行1.5 h即達(dá)到平衡,因此三聚氰酸的合成時(shí)間控制在1.5 h為宜。

2.1.413C3-三聚氰酸的合成與表征

在上述合成工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,確定最佳工藝條件為:尿素0.083 mol、環(huán)丁砜8 mL、反應(yīng)壓力0.013 MPa、反應(yīng)溫度 205℃、反應(yīng)時(shí)間1.5 h。以13C-尿素(13C豐度為98.50%)為標(biāo)記前體,進(jìn)行三聚氰酸合成的豐度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,產(chǎn)品收率83.2%。13C3-三聚氰酸的色譜保留時(shí)間為3.77 min,與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致。采用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定量,純度為99.2%,13C同位素豐度為 98.10%,同位素豐度下降了0.40%。

表3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成三聚氰酸收率的影響

產(chǎn)物表征:用元素分析儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行元素分析(%),C3H3N3O3實(shí)測(cè)值(計(jì)算值):C 27.82(27.91);H 2.53(2.34);N 32.22(32.56);IR(υ/cm-1,KBr):3 113.8 、3 028(νO-H),1 777.5、1 751.7、1 720(νC=N,三嗪環(huán)中碳氮雙鍵),1 464.3、1 398.5(νC-N,三嗪環(huán)中碳氮單鍵),775.2、754.1為三嗪環(huán)特征峰;MS:m/z=128為三聚氰酸的[M-H]-峰,m/z=85為[C2H 2N2O2]-峰,m/z=42為[N≡C-O]-峰。合成的高豐度同位素標(biāo)記13C3-三聚氰酸,由于三嗪上碳原子為同位素13C標(biāo)記,其質(zhì)量數(shù)增加3個(gè)單位,[M-H]-峰為m/z=131,主要碎片離子相應(yīng)變?yōu)閙/z=87、43。

2.2 15N3-三聚氰胺的合成

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)三聚氰胺收率的影響

三聚氰氯具有三嗪化合物的反應(yīng)特性:3個(gè)Cl原子可分步取代,使用極性介質(zhì)有利于反應(yīng)進(jìn)行[9-10,13]。考慮到主要反應(yīng)物三聚氰氯和氨水的溶解性,分別選用丙酮、二氧六環(huán)、水、甲苯作為反應(yīng)介質(zhì),反應(yīng)按1.4節(jié)進(jìn)行,其他條件不變,只改變反應(yīng)介質(zhì)。常壓下各介質(zhì)在相應(yīng)的回流溫度下進(jìn)行反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4。由表4可知,當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)為二氧六環(huán)時(shí),產(chǎn)物以三聚氰胺為主。因此,選擇以二氧六環(huán)作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.2.2 反應(yīng)溫度對(duì)三聚氰胺收率的影響

由于氨水的易揮發(fā)性,實(shí)驗(yàn)采用不銹鋼反應(yīng)釜。反應(yīng)按1.4節(jié)進(jìn)行,以二氧六環(huán)為溶劑,其他條件不變,只改變反應(yīng)溫度,同時(shí)保持體系密閉,實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表5。由表5可知,適度升高反應(yīng)溫度有利于提高三聚氰胺產(chǎn)率,在130～140℃范圍內(nèi)即可獲得理想的收率。隨著反應(yīng)溫度進(jìn)一步升高,產(chǎn)物收率略有下降,因此,反應(yīng)溫度以130～140℃為宜,此時(shí)三聚氰胺的收率＞96%。

表4 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)三聚氰胺收率的影響

表5 反應(yīng)溫度對(duì)三聚氰胺收率的影響

2.2.3 溶劑用量對(duì)三聚氰胺收率的影響

1.4 節(jié)反應(yīng)中,改變?nèi)軇┯昧?其他條件不變,實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表6。三聚氰氯的分步取代反應(yīng)需要適宜的反應(yīng)環(huán)境。溶劑量過(guò)少,三聚氰氯溶解不夠充分;而溶劑量過(guò)多又會(huì)造成三聚氰氯濃度降低,影響反應(yīng)的收率。由表6可以看出,在本實(shí)驗(yàn)的配比下,溶劑二氧六環(huán)用量為40 mL,三聚氰胺收率最高,可達(dá)98%。

表6 溶劑用量對(duì)合成三聚氰胺的影響

2.2.415N3-三聚氰胺的合成與表征

在上述合成工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,確定最佳工藝條件為三聚氰氯0.04 mol、二氧六環(huán)40 mL、NH 3 0.024 mol、反應(yīng)溫度 130～140 ℃、反應(yīng)時(shí)間4 h。以15N-氯化銨(99.55%15N)為標(biāo)記前體,進(jìn)行三聚氰胺合成的豐度實(shí)驗(yàn),產(chǎn)品收率97.2%。15N3-三聚氰胺的色譜保留時(shí)間為16.98 min,與標(biāo)樣的保留時(shí)間一致。采用外標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定量,純度為99.7%,MS檢測(cè)15N同位素豐度為99.49%,產(chǎn)物的同位素豐度下降＜0.1%。此結(jié)果表明,所合成的15N3-三聚氰胺可以作為同位素內(nèi)標(biāo)。

產(chǎn)物表征:用元素分析儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行元素分析(%),C3N 6H 6實(shí)測(cè)值(計(jì)算值):C 28.44(28.56);N 66.72(66.64);H 4.84(4.80);IR(υ/cm-1,KBr):3 468.6 、3419.3(νN-H),1 685.1、1 649.3(νC=N,三嗪環(huán)中碳氮雙鍵);LC-MS檢測(cè):m/z=127為[M+H]+峰,m/z=110為[M-NH 2]+峰,m/z=85為[C2 N4H 5]+峰,應(yīng)是母離子[C3N6 H7]+脫掉NCNH 2后形成的子離子,m/z=68為[C2N3H2]+峰,為 C2N4H5+脫去NH 3所得。在高豐度同位素標(biāo)記15N3-三聚氰胺的質(zhì)譜圖上,m/z=130為[M+H]+峰,由于3個(gè)氨基上N元素均為15N,其質(zhì)量數(shù)增加3個(gè)單位,m/z=112為[C314N 315N2 H4]+峰,m/z=87為[C215N 214N 2H 5]+峰。

3 結(jié) 論

(1)設(shè)計(jì)并完成了適合穩(wěn)定同位素標(biāo)記用內(nèi)標(biāo)物13C3-三聚氰酸、15N3-三聚氰胺的合成工藝。以15N-氯化銨為原料,經(jīng)分步取代合成得到15N3-三聚氰胺;以13C-尿素為原料,采用高沸點(diǎn)溶劑,經(jīng)液相合成方法制備得到13C3-三聚氰酸。

(2)考察了合成條件對(duì)產(chǎn)品收率的影響,獲得了較優(yōu)的合成工藝。

(3)產(chǎn)品經(jīng)HPLC、MS檢測(cè),化學(xué)純度大于99%,同位素豐度高于98%,可作為同位素內(nèi)標(biāo)應(yīng)用。

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