燕窩對(duì)ConA刺激下大鼠淋巴細(xì)胞增殖的增效作用

侯 雁，冼小敏，林潔茹，賴小平，陳建南

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510405）

燕窩（Ediblebird'snest,EBN）是指雨燕科（Apodidae）若干種金絲燕單獨(dú)使用唾液分泌物或黏合羽毛、植被所筑的巢窩。據(jù)曹炳章的《燕窩考》中記載，燕窩能“養(yǎng)胃液，滋肺陰，生津益血，潤(rùn)燥澤枯，壯陽益氣，和中開胃，填精補(bǔ)髓，止咳化痰”，現(xiàn)代多認(rèn)為燕窩具有免疫促進(jìn)作用[1]。為此，本文探討了不同品種燕窩及其偽品對(duì)ConA刺激大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的增效作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原燕窩（白燕窩半加工品）、白燕窩、黃燕窩、血燕窩、即食燕窩均由新加坡錦興公司提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為爪哇金絲燕產(chǎn)燕窩[2]；懷集燕窩來自廣東省懷集縣，同法鑒定為小白腰雨燕窩；草燕窩產(chǎn)自菲律賓，由新加坡菲利公司提供。市售燕窩經(jīng)mtDNA序列測(cè)定[2]以及SDS-PAGE電泳圖譜鑒定為偽品；而燕窩的常見偽品豬皮、明膠則購自傳統(tǒng)市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) SD 大鼠 5只，4~6周齡，雄性，體重（190±10）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要試劑

RPMI-1640干粉，廣州合達(dá)生物有限公司；伴刀豆蛋白A（ConA），Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清，上海微科生化試劑公司；Bradford蛋白定量試劑盒，Tiangen 17803；胃蛋白酶、胰蛋白酶，AMRECO公司。

1.4 主要儀器

Sartorius分析天平 BS110S；Eppendrof臺(tái)式冷凍離心機(jī)5810R；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀GENios；恒溫水浴鍋HH-2，江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.5 試劑配制

1.5.1 RPMI-1640培養(yǎng)基

10 g RPMI-1640 干粉，0.11 g Na2CO3，5.925 g Hepes，用雙蒸水定容至1 000 ml，過濾滅菌，-40℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.5.2 RPMI-1640完全培養(yǎng)液

在RPMI－1640培養(yǎng)液中加入胎牛血清、青霉素、鏈霉素和β-巰基乙醇，使其終濃度分別為10%、100 U/ml、5 mM。

1.5.3 2×人工胃液配方

NaCl 4.0 g，胃蛋白酶 6.4 g，濃鹽酸 14 ml，雙蒸水定容于1 000 ml。 pH 約為 1.2[3]。

1.5.4 2×人工腸液配方

13.6 gKH2PO4溶于250ml雙蒸水，振蕩完全溶解后加190ml 0.2 mol/LNaOH和400 ml雙蒸水。加胰蛋白酶20 g，混勻，用0.2 mol/L NaOH調(diào)pH到7.5±0.1，雙蒸水定容置1 000 ml[3]。

1.6 方法

1.6.1 大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備

取大鼠1只，用無菌剪刀和鑷子取其腸系膜淋巴結(jié)，用磨棒小心研磨過120目篩網(wǎng)，并用PBS清洗。加PBS至4ml，室溫800 r/5 min離心，棄上清，重復(fù)操作2次。RMPI-1640完全培養(yǎng)基懸浮沉淀，6 g/L臺(tái)盼藍(lán)拒染，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml[4]。

1.6.2 燕窩樣品制備

1.6.2.1 水提取液：取原燕窩粉末適量，加45BV雙蒸水室溫浸泡1 h，分別在60、80、100℃水浴中提取3 h，離心取上清，過濾滅菌。Bradford法檢測(cè)上清液的蛋白質(zhì)濃度。用RPMI-1640培養(yǎng)液分別稀釋至濃度為 5.7、14.0、34.0、127.0、180.0 μg/ml。

1.6.2.2 人工胃液消化物[3]：將上述60℃提取的燕窩蛋白質(zhì)濃度縮至1 mg/ml。加入同等體積2×人工胃液，37℃消化1 h，立即加入0.168 mol/LNa2CO3調(diào)pH為7~8終止反應(yīng)。離心取上清，過濾滅菌。

1.6.2.3 人工腸液消化物[3]：取同樣燕窩濃縮液，加入同等體積2×人工腸液，37℃消化1 h，90℃加熱5 min滅酶。離心取上清，過濾滅菌。

1.6.3 MTT法測(cè)定大鼠淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

用 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋成 1×106、2×106、5×106個(gè)/ml 3 個(gè)濃度，取 200 μl于 96 孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 分別于 12、24、36、48、60、72、84、96 h 用 MTT 比色法測(cè)定細(xì)胞在570 nm處OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6.4 Con A濃度對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

實(shí)驗(yàn)組取2×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液200μl于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入 20 μl不同濃度的 ConA（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml）共同培養(yǎng)，調(diào)零組僅加培養(yǎng)基 200 μl，對(duì)照組僅加細(xì)胞懸液200μl，每組設(shè) 3個(gè)重復(fù)。37℃，5%CO2培養(yǎng) 48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 mg/ml MTT溶液20μl。培養(yǎng)結(jié)束后，室溫2 000r/5min離心，棄上清，加入150μl DMSO溶液震蕩30 s，靜止20 min。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)各孔OD值。

1.6.5 燕窩濃度對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

取3組2×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液200μl和60℃提取的不同濃度（5.7、14.0、34.0、127.0、180.0 μg/ml）原燕窩提取液置 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，一組不加ConA，其余兩組分別加入濃度為2μg/ml和4μg/ml的ConA；調(diào)零組A僅加培養(yǎng)基200μl，調(diào)零組B（排除顏色干擾）同時(shí)加200μl培養(yǎng)基和180μg/ml燕窩提取液20 μl，對(duì)照組僅加 2×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液 200 μl。 同法測(cè)定 570 nm處各孔OD值。

1.6.6 爪哇金絲燕不同處理方法對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

分別取兩組2×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液200μl和不同方法制備的燕窩提取液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，一組不加ConA，另一組加2μg/ml ConA；調(diào)零組、對(duì)照組同上。同法測(cè)定570 nm處各孔OD值。

1.6.7 不同品種燕窩及其偽品對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

取2×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液200μl和不同品種燕窩及其偽品提取液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入2μg/ml ConA；調(diào)零組、對(duì)照組同上。同法測(cè)定淋巴細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)下各孔OD值。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測(cè)定大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，濃度為5×106個(gè)/ml的淋巴細(xì)胞在48 h內(nèi)數(shù)目不斷增加，此后則呈現(xiàn)衰退狀態(tài)；濃度為2×106個(gè)/ml的淋巴細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)呈持續(xù)緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)；濃度為1×106個(gè)/ml的淋巴細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)數(shù)量緩慢減少。故其最佳培養(yǎng)濃度為2×106個(gè)/ml，檢測(cè)時(shí)間設(shè)定為 48 h。

2.2 ConA濃度對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

如圖2所示，ConA濃度低于2μg/ml時(shí)，沒有表現(xiàn)出促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，當(dāng)濃度超過2μg/ml開始出現(xiàn)明顯的促轉(zhuǎn)化作用，隨著濃度升高，轉(zhuǎn)化作用持續(xù)增強(qiáng)；直到濃度超過16μg/ml，對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化逐漸減弱。

2.3 燕窩濃度對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

如圖3所示，不加ConA組燕窩不能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，燕窩濃度對(duì)其亦沒有太大影響；其余兩組淋巴細(xì)胞增殖明顯，由于3條曲線成平行趨勢(shì)，故認(rèn)為大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化主要與ConA有關(guān)，與是否添加燕窩關(guān)系不大，燕窩的濃度對(duì)其影響較小。兩組加入不同濃度ConA的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度差異不大，但比較之下，低濃度ConA促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化量緩慢的增加，呈劑量依賴關(guān)系，故認(rèn)為ConA的最佳濃度為2μg/ml；淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化受燕窩濃度影響不明顯，故考慮到冷凍干燥后的燕窩粉末復(fù)溶較困難，不易得到較高濃度的燕窩樣品，故將其濃度確定為40μg/ml。

BNE為燕窩提取物縮寫，下同

2.4 爪哇金絲燕不同處理方法對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

如圖4所示，和對(duì)照組相比，不加ConA組燕窩沒有促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用；ConA組燕窩促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用明顯，其中胃蛋白酶消化后的燕窩樣品促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)，其次是胰蛋白酶消化樣品；而水提取樣品中，60℃水提取的燕窩促淋巴細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，隨著溫度的增高，增殖作用均有所減弱。

2.5 不同品種燕窩及其偽品對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

如圖5所示，不加ConA組除了市售燕窩和黃燕窩外，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用均低于對(duì)照組；加入ConA后淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有所提高，樣品組除銀耳外均有輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，其中原燕窩、黃燕窩、白燕窩和懷集燕窩輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用最強(qiáng)，其次是即食燕窩、血燕窩和市售燕窩；草燕窩作用最弱，僅比偽品豬皮、銀耳略高。

3 討論

燕窩始載于清朝張璐的《本草逢原》，具有潤(rùn)肺滋陰，化痰止嗽；開胃氣，利勞痢；益氣補(bǔ)中，壯陽，添精補(bǔ)髓的功效。一般認(rèn)為，燕窩平均含有9%水分，20%無機(jī)灰分，32.3%蛋白質(zhì)和38.7%碳水化合物，主要成分是一種黏蛋白樣的糖蛋白[5-6]。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，張玫等[7]對(duì)珍珠燕窩提取液進(jìn)行藥理試驗(yàn)顯示，珍珠燕窩提取液能提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及提高小鼠血液IgM含量。M.H.NG觀察了燕窩水提物對(duì)人外周單核細(xì)胞在凝集素刺激下有絲分裂的促進(jìn)作用[8]。

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的原理是T淋巴細(xì)胞在有絲分裂原（如ConA,PHA）的刺激下，引起細(xì)胞內(nèi)新的DNA合成及細(xì)胞分化，從而發(fā)生一系列增殖變化。和放射性同位素標(biāo)記法和形態(tài)學(xué)法比較起來，MTT比色法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、安全價(jià)廉，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域中[9-11]。與M.H.NG實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的燕窩輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用并沒有消失，甚至超過了60℃燕窩水體液，可見胃蛋白酶和胰蛋白酶沒有影響燕窩的活性；有研究顯示，寡糖鏈能修飾并改變蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性，保護(hù)多肽鏈不被蛋白酶水解[12]。在前期研究中筆者亦發(fā)現(xiàn)，早期研究中的燕窩活性蛋白確實(shí)有可能避開胃腸道的消化降解，直接作用于腸上皮細(xì)胞發(fā)揮作用。而隨著提取溫度的升高，燕窩輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用開始下降，這說明這種活性蛋白有可能具有熱敏感性。

由黃燕窩制作的即食燕窩仍表現(xiàn)出了和原物質(zhì)相似的性質(zhì)，可見罐頭的加工過程并沒有損耗燕窩樣品中的活性物質(zhì)；除銀耳外，其他所有樣品均表現(xiàn)出輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，其中以未經(jīng)加工處理的原始燕窩作用最強(qiáng)，由此可見，加工過程會(huì)對(duì)燕窩活性物質(zhì)產(chǎn)生一定影響；在輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)中，懷集燕窩表現(xiàn)出了和燕窩中品質(zhì)較高的黃燕窩、白燕窩一樣的作用，可猜測(cè)其中均含有共同的活性物質(zhì)，由于懷集燕窩含雜質(zhì)較多，加工處理過程繁瑣，雖進(jìn)入市場(chǎng)但商品價(jià)值較低。有人認(rèn)為血燕窩之所以呈現(xiàn)紅色與燕子棲息巖洞中的礦物質(zhì)有關(guān)；如果這個(gè)假設(shè)是成立的，市場(chǎng)上血燕窩的數(shù)量必定稀少。筆者猜測(cè)，目前大量于市場(chǎng)中流通的血燕窩其中大部分是采用水溶性或脂溶性染料加工成的染色燕窩，故導(dǎo)致其活性物質(zhì)減少，輔促淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用減弱。

蛋白多糖是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、黏附、遷移、信息傳遞和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成，在細(xì)胞免疫方面起著重要作用[13]。在SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中，筆者亦證明燕窩中含有大量糖蛋白，燕窩輔促大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的活性物質(zhì)是否為糖蛋白，仍需要在進(jìn)一步分離燕窩蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上驗(yàn)證。綜上所述，燕窩不能直接促進(jìn)大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但對(duì)低濃度ConA誘導(dǎo)下淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有一定增強(qiáng)作用。推測(cè)其原因是其具有T淋巴細(xì)胞有絲分裂原的性質(zhì)，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分裂增殖，反映了集體細(xì)胞免疫水平，但推測(cè)燕窩具有細(xì)胞免疫增強(qiáng)作用則需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]Ng MH,Chan KH,Kong YC．Potentiation of mitogenic response by extractsof theswiftlet's(Collocalia)nest[J]．BiochemInternational,1986,13(3):521-531．

[2]Lin JR,Zhou H,Lai XP,et al．Genetic identification of edible birds'nest based on mitochondrial DNA sequences[J]．Food Research International,2009,42(8):1053-1061．

[3]Board of Trustees．The United States Pharmacopeia[S]．the United States,1995:2053．

[4]高娟,李芳蘭,周一珺,等.不同發(fā)育時(shí)期大鼠小腸粘膜及派氏結(jié)T淋巴細(xì)胞發(fā)育活化的研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2009,25(8):678-683．

[5]Wang CC．The composition of Chinese edible bird’s nest and the nature of their proteins[J].Biol ChemBaltimore,1921,49:429-439.

[6]O'Farrell PH．High resolution two-dimensional electrophoresisof proteins[J]．Biol Chem,1975,250(10):4007-4021．

[7]張玫,王道生．珍珠燕窩提取液的功效試驗(yàn)[J].藥物生物技術(shù),1994,1(2):49－51．

[8]侯溫甫,楊文鴿.糖鏈及其蛋白質(zhì)糖基化[J].生物技術(shù)通報(bào),2005,20(3):14-17.

[9]張濤,趙蕊,柳朝陽,等．川芎嗪對(duì)T淋巴細(xì)胞活化增殖的影響[J]．中國老年學(xué)雜志,2009,29(13):1658-1659．

[10] 陳光星,李曉娟,劉清平,等．青藤堿對(duì)T淋巴細(xì)胞活化增殖的影響[J]．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25（5）:425-428．

[11]張雷,鄭芙林,李珊珊,等．隱丹參酮對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥,2010,21(1):92-93．

[12]Erkki R．Proteoglycans in cell regulation[J]．Biol Chemistry,1989,264(23):13369-13372．

[13]劉英,程翔,廖玉華．地爾硫卓對(duì)刀豆凝集素誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2010,26(3):376-378．