HPLC法測定自發性高血壓大鼠血漿中去甲腎上腺素的含量Δ

梁秋云，黃慧學，劉華鋼，蒙華琳

（1.廣西醫科大學，南寧市 530021；2.廣西中醫學院，南寧市 530021；3.廣西柳州醫學高等專科學校，柳州市 545006）

去甲腎上腺素（NA）是重要的單胺類遞質，測定其血漿濃度可為高血壓、帕金森氏病、甲亢、嗜鉻細胞瘤和神經母細胞瘤等診斷定位提供依據[1]。國內、外測定血漿中NA含量報道的方法主要有高效液相色譜（HPLC）-電化學檢測法、HPLC-熒光法及毛細管電泳法等[1～3]，但大部分方法的樣品處理較復雜，對儀器設備的要求較高或靈敏度低；紫外檢測器是HPLC最常配備的檢測器，應用范圍廣，目前還未見采用HPLC-紫外檢測（UV）法測定血漿中NA的報道。本實驗以可能具有高血壓治療作用的多糖為模擬藥物，同時設立陽性對照藥卡托普利片，建立HPLC-UV法測定自發性高血壓大鼠（SHR）血漿中NA含量的方法，為臨床診斷和基礎研究提供一種快速、簡便、準確測定血漿中NA的含量測定方法。

1 材料

HPLC儀，包括2487紫外可見檢測器、柱溫箱、Breeze3.3工作站（美國沃特斯公司）；C18色譜柱（大連依利特分析儀器有限公司）；TGL-16C高速微量離心機（上海安亭科學儀器廠）；751型紫分光光度計（上海分析儀器總廠）。

仙人掌果采于廣西北海潿洲島，經廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定為仙人掌Opuntia dillenii（Ker.-Gawl.）Haw.植物的果實。仙人掌果多糖（CPFP）由上述仙人掌果經本課題項目組提取、純化制得（多糖含量大于70%）；NA對照品（瑞士Fluka公司，批號：2002298，純度：≥98%）；陽性對照藥卡托普利片（汕頭金石制藥總廠，批號：070311，規格：每片25 mg）；甲醇為色譜純，水為去離子重蒸水，其余試劑均為分析純。

SHR，♂，12周齡，體質量（220±50）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（滬）2003-0003；同齡♂Wistar大鼠由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2003-0003。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.15 mol·L－1磷酸二氫鉀緩沖液（1∶9，V/V，pH＝6.0）；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：280 nm。

2.2 給藥、分組及血樣處理

SHR隨機分為5組：CPFP高、中、低劑量組和陽性對照藥組、模型組，每組10只，另取正常血壓的Wistar大鼠10只為正常對照組。CPFP高、中、低劑量組分別ig 2.37、1.58、0.76 g·kg－1·d－1（劑量由預試驗確定）CPFP；陽性對照藥組ig 10 mg·kg－1·d－1（劑量由臨床給藥劑量確定）卡托普利，正常對照組及模型組ig無菌注射用水，各組大鼠每天給藥1次，連續9周。9周末自腹主動脈取血，血樣收集于1.5 mL肝素離心管中，及時于4 ℃、2000 r·min－1離心，取血漿100 μL，加0.05 mol·L－1高氯酸200 μL，10000 r·min－1離心2 min，取上清液置于－20 ℃冰箱中待測。

2.3 方法專屬性

取陰性溶液（流動相）、0.05 mol·L－1高氯酸溶解的NA對照品溶液和給藥9周后的血漿樣品處理溶液進樣，色譜見圖1。

圖1 SHR血漿樣品中NA的HPLC色譜圖A.陰性溶液；B.對照品；C.血漿樣品；1.NAFig 1 HPLC chromatograms of NAin plasma of SHRA.negative solution；B.standard substance；C.plasma sample；1.NA

在選定的色譜條件下，NA峰形良好，分離完全，其保留時間為3.05 min；以NA計算理論塔板數不小于3000；其它內源性物質基本不干擾測定。

2.4 線性范圍和最低檢測限

取干燥至恒重的NA對照品適量，精密稱定，用0.05 mol·L－1高氯酸溶解并分別稀釋成0.5 g·L－1的對照品貯備液。

精密吸取貯備液1、20、40、60、80 μL，分別稀釋為0.5、10、20、30、40 μg·L－1，以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程為Y＝271906X－14910（r＝0.9999）。以3倍信噪比計算出NA檢測限為0.05μg·L－1。

2.5 精密度及穩定性試驗

取“2.2”項下其中1份血樣，分別于同日內重復測定5次，求得日內精密度；每日2次，重復測5 d，求得日間精密度。結果，日內精密度的RSD＝2.15%，日間精密度的RSD＝3.81%，表明儀器精密度良好。

將已知NA濃度的血樣置于－20℃下存放，于1、3、5、7 d再測試其含量，考察樣品放置穩定性。結果RSD＝2.08%，表明血漿中NA在－20℃下至少能穩定7 d。

2.6 回收率試驗

因NA為內源性物質，故用加入法測定回收率，即通過向已知濃度的樣本提取液中加入一定量的NA貯備液，按“2.1”色譜條件進行測定，扣除樣品中原有的含量，求出NA的加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Results of recovery test（n＝5）

2.7 血漿樣品中NA的含量測定

取各組血樣按上述色譜條件進樣分析，各組NA含量結果詳見表2。

表2 各組血樣中NA含量測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Content determination of NA in plasma of SHR of each group（ ±s，n＝10）

表2 各組血樣中NA含量測定結果（±s，n＝10）Tab 2 Content determination of NA in plasma of SHR of each group（ ±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

NA含量/μg·L－1 8.89±1.5618.03±1.8714.15±2.09＊＊16.31±1.64＊17.27±2.1511.45±2.30＊＊組別正常對照組模型組CPFP高劑量組CPFP中劑量組CPFP低劑量組陽性對照藥組

由表2可知，所建立方法不但能測定各組大鼠中NA含量，同時還表明給藥9周后，與模型組比較，CPFP高劑量組、陽性對照藥組NA含量顯著降低（P＜0.05），提示所建立的NA含量測定方法可用于高血壓治療藥物的藥動學研究。

3 討論

樣品處理方法的選擇對測定血樣中微量NA含量十分重要。文獻報道[1～3]的血樣的處理方法中多以氧化鋁吸附法或溶劑萃取法進行提取，成本較高，步驟煩瑣。本實驗直接采用0.05 mol·L－1高氯酸處理樣品，與其他提取法相比，操作簡便、快速，且回收率高。

NA屬堿性化合物，而酸性條件下堿性物質出峰時間將縮短，堿性條件下堿性物質出峰時間會延長[4]，因此選擇適宜pH值的流動相十分重要。本實驗前期對不同pH值的磷酸鹽緩沖液進行考察后，發現流動相的pH值在6.0左右最有利于樣品的檢測和分離。

本實驗前期對NA進行紫外波長下掃描，發現NA在280 nm波長處有最大吸收峰，故選擇280 nm作為檢測波長。

綜上所述，本方法線性、精密度、回收率良好，靈敏度高，操作簡便，可用于NA的藥動學及相關研究。

[1]吳燕川，馮秀麗，何士大，等.樣品固相萃取及高效液相色譜法測定血漿中去甲腎上腺素[J].首都醫科大學學報，2005，26（6）：760.

[2]鄭春梅，張惠云.大鼠血清中單胺類遞質的高效液相色譜-熒光檢測法分析[J].藥物分析雜志，2006，26（2）：215.

[3]付 敏，張東朋，馬萬云，等.多巴胺和5-羥色胺的毛細管電泳測定[J].分析測試學報，2002，21（2）：1.

[4]謝笑龍，楊鄲莉，李志梅，等.血漿兒茶酚胺的同時提取及反向高效液相測定法[J].遵義醫學院學報，2005，28（4）：324.