果糖二磷酸鉀鹽抗缺血再灌注心律失常作用的實驗研究

楊輝，周遠大，何海霞

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院藥劑科，重慶市 400016；2.重慶醫科大學附屬第一醫院臨床藥理教研室，重慶市 400016）

急性心肌缺血缺氧及應用洋地黃過量的患者，常伴有心肌細胞內鉀的明顯丟失，容易發生致命性心律失常或猝死[1]。同時，急性心肌缺血發生后由于激活了交感系統，更易出現低血鉀，因此，及時補鉀對急性心肌缺血的搶救和預后具有重要的臨床價值[2]。已證實1，6-二磷酸果糖（FDP，鈉鹽）能維持糖酵解，保證缺血、缺氧等病理狀態下心肌細胞的能量供應，還具有穩定細胞膜、維持離子泵正常功能、抑制氧自由基產生的作用[3]。而果糖二磷酸鉀鹽（Potassium fructose diphosphate，FDPK）是由二磷酸果糖鈉鹽磷酸基團上的鈉離子被鉀離子取代而形成，因此，推測FDPK對心律失常也有良好的治療效果。本實驗通過大鼠缺血再灌注心律失常模型與家兔低鉀血癥模型，探討FDPK的抗缺血再灌注心律失常作用及其機制。

1 材料

1.1 試藥

FDPK（重慶醫科大學基礎醫學院生物醫學工程研究室提供，批號：419536，純度：99.5%）；注射用FDP（意大利Foscama生化制藥公司，批號：2002050，規格：每瓶5 g）；FDPK和FDP用蒸餾水配成溶液使用；氯化鉀注射液（批號：0402071，規格：1 g·10 mL－1）、呋塞米注射液（批號：04070001，規格：20 mg·2 mL－1）均由西南藥業股份有限公司提供；門冬氨酸鉀鎂注射液（匈牙利吉瑞大藥廠，批號：A460101A，規格：452 mg·10 mL－1）；氨基甲酸乙酯（烏拉坦，中國醫藥（集團）上海化學試劑公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、脂質過氧化產物丙二醛（MDA）、三磷酸腺苷（ATP）酶及組織蛋白測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 動物

Wistar大鼠60只（動物合格證批號：24301045），♂，體質量180～230 g；新西蘭家兔24只（動物合格證批號：24301047），♀♂不拘，體質量2.0～2.5 kg，均由重慶醫科大學實驗動物中心提供。

1.3 儀器

MPA-2000型多道生物信號分析系統（第二軍醫大學研制）；ECG-6511型心電圖機（上海光電醫用電子儀器有限公司）；江灣Ⅱ型小動物呼吸機（上海醫療器械六廠）；BP61電子分析天平、鉀離子選擇性電極（德國Sartorius公司）；VXH-3微型漩渦混合器（上海躍進醫療器械廠）；低溫醫用冰箱（日本Sanyo公司）；UVIMINI-1240型紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）。

2 方法

2.1 造模與給藥

取60只Wistar大鼠，參照文獻[4，5]，建立大鼠缺血再灌注心律失常模型（結扎冠狀動脈左前降支10 min，松開結扎線60 min），以收緊結扎線后心電圖有2個以上導聯S-T段↑≥0.1 mv，放松后S-T段↓＜1/2以上為模型成功。同時各組大鼠股靜脈插管，以備給藥。將模型成功的大鼠隨機分為6組：模型對照組（給予等容量生理鹽水），FDPK大、中、小劑量組（80、40、20 mg·kg－1，劑量選取依據：由于FDPK小鼠靜脈注射后LD50為400.05 mg·kg－1，以其1/5、1/10、1/20為FDPK大、中、小劑量），陽性對照FDP組（37.1 mg·kg－1，約等于40 mg·kg－1FDPK中FDP的含量）和氯化鉀組（12.2 mg·kg－1，約等于40 mg·kg－1FDPK中鉀的含量）；各組給藥容量均為1 mL·100 g－1。以上各組于缺血10 min后分別通過股靜脈一次給予相應的藥物，維持至再灌注后5 min。

取新西蘭家兔24只，由耳緣靜脈給予呋塞米注射液2 mg·kg－1，每天2次，連續給藥6 d，建立家兔低鉀血癥模型[6]。以血清鉀離子濃度低于3 mmol·L－1為模型成功。將模型成功的家兔隨機分成4組（參照臨床常用的補鉀方案，除模型對照組外，各組均靜脈輸注40 mmol·L－1的鉀離子，給藥容積50 mL·kg－1體質量）：模型對照組給予等容量生理鹽水，氯化鉀（陽性對照）組給予0.3%氯化鉀溶液，門冬氨酸鉀鎂（陽性對照）組給予1.34%門冬氨酸鉀鎂溶液，FDPK組給予0.98%FDPK溶液。各組家兔由股靜脈一次滴入相應藥物。補液過程持續90 min，并于靜滴開始后120 min采血5 mL以Ficoll分離液分離淋巴細胞待測。

2.2 心電圖的觀察及心律失常評分

用心電圖機（ECG-6511）連續記錄Ⅱ導聯心電圖及MPA-2000型生物信號處理系統動態監測心電圖的變化，并分別記錄缺血0～15 min，再灌注0～10 min、10～20 min、20～30 min、30～60 min時間段室性早搏數（VEBs），室性心動過速持續時間（VTt）及室顫持續時間（VFt）。對缺血期和再灌注期出現的室性心律失常（VA）分別進行Curtis評分[7]，評分結果為0～5分，分值越低，心律失常越不明顯。

2.3 心肌組織中蛋白含量、MDA含量、SOD活性和ATP酶活性測定

冠狀動脈結扎75 min后放血處死大鼠，取左心室廣泛蒼白缺血區心肌約100 mg，準確稱重，加生理鹽水適量，在冰水中制成10%（W/V）組織勻漿，離心（3000 r·min－1，15 min），取上清液，用定磷法測定ATP酶（Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶）活性、黃嘌呤氧化酶比色法測定SOD活性、硫代巴比妥酸比色法測定MDA含量和考馬斯亮蘭法測定總蛋白含量。

2.4 低鉀血癥家兔淋巴細胞內鉀濃度測定

參照文獻[8]，用鉀離子選擇性電極測定家兔外周血淋巴細胞內鉀離子濃度。

2.5 統計方法

3 結果

3.1 FDPK對缺血再灌注心律失常的影響

各組不同時間段心律失常評分結果見表1。

表1 各組大鼠心律失常評分（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of arrhythmia scores of every group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠心律失常評分（±s，n＝10）Tab 1 Comparison of arrhythmia scores of every group（±s，n＝10）

與模型對照組比較：□P＜0.05，■P＜0.01；與氯化鉀組比較：#P＜0.05，＊P＜0.01；與FDP組比較：◇P＜0.05vs.model group：□P＜0.05，■P＜0.01；vs.KCl group：#P＜0.05，＊P＜0.01；vs.FDP group：◇P＜0.05

從表1可見，與模型對照組比較，FDPK可以劑量依賴性地在缺血0～15 min和再灌注期間0～20 min時間段減少Curtis評分值，尤其是FDPK大、中劑量組在缺血0～15 min和再灌注期間0～20 min時間段可減少室性心律失常的發生，與模型對照組相比有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。且FDPK大、中劑量組降低Curtis評分值比FDP組、氯化鉀組更明顯，提示FDPK比FDP、氯化鉀有更好的抗心律失常作用。

3.2 FDPK對缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織中SOD活性、MDA含量的影響

各組SOD活性和MDA含量結果見表2。

表2 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量（±s，n＝10）Tab 2 The activity of SOD and the content of MDA in myocardium of rats（±s，n＝10）

表2 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量（±s，n＝10）Tab 2 The activity of SOD and the content of MDA in myocardium of rats（±s，n＝10）

與模型對照組比較：■P＜0.01；與氯化鉀組比較：#P＜0.05，★P＜0.01；與FDP組比較：◇P＜0.05，◆P＜0.01vs.model group：■P＜0.01；vs.KCl group：#P＜0.05，★P＜0.01；vs.FDP group：◇P＜0.05，◆P＜0.01

由表2可見，FDPK具有劑量依賴性地增強SOD活性、降低心肌中MDA含量的趨勢，但僅有FDPK大、中劑量組作用明顯，與模型對照組比較具有顯著性差異（P＜0.01），提示FDPK能抑制脂質過氧化反應對心肌的損害。

3.3 FDPK對缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織中ATP酶活性的影響

各組ATP酶活性檢測結果見表3。

表3 各組大鼠缺血區心肌組織中ATP酶活性結果（nmol Pi·h－1·g－1protein，±s，n＝10）Tab 3 The activity of ATPnase in myocardium of ischemia-reperfusion induced arrhythmia rat（snmol Pi·h－1·g－1 protein，±s，n＝10）

表3 各組大鼠缺血區心肌組織中ATP酶活性結果（nmol Pi·h－1·g－1protein，±s，n＝10）Tab 3 The activity of ATPnase in myocardium of ischemia-reperfusion induced arrhythmia rat（snmol Pi·h－1·g－1 protein，±s，n＝10）

與模型對照組比較：□P＜0.05，■P＜0.01；與氯化鉀組比較：#P＜0.05，★P＜0.01；與FDP組比較：◇P＜0.05，◆P＜0.01vs.model group：□P＜0.05，■P＜0.01；vs.KCl group：#P＜0.05，★P＜0.01；vs.FDP group：◇P＜0.05，◆P＜0.01

組別模型對照組FDPK組FDPK組FDPK組FDP組氯化鉀組Ca2+-ATP酶1.6±0.83◇2.77±1.21■★2.97±0.7■★4.93±1.91■◆★2.48±1.1□☆1.68±0.56◇劑量/mg·kg－1 20408037.112.2 Na+-K+-ATP酶1.78±0.93.06±1.24■★4.39±1.18■◆★6.26±1.94■◆★2.32±1.091.75±0.78 Mg2+-ATP酶1.92±0.74#2.61±1.08□★2.85±1.37□★4.31±0.95■◆★2.27±1.2#1.54±0.39□◇

由表3可見，FDPK可劑量依賴性地升高Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性。FDPK大、中劑量組與模型對照組比較具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。提示FDPK大、中劑量組能維持缺血缺氧狀態下離子泵的正常功能，且作用優于FDP組的氯化鉀組。

3.4 FDPK對低鉀血癥家兔淋巴細胞內鉀離子濃度的影響

各組兔靜脈給藥后120 min取血分離淋巴細胞測定細胞內鉀濃度結果見表4。

表4 各組兔淋巴細胞內鉀濃度結果（mmol·L－1，±s，n＝6）Tab 4 Concentration of potassium ion in lymphocyte of rabbit（smmol·L－1，±s，n＝6）

表4 各組兔淋巴細胞內鉀濃度結果（mmol·L－1，±s，n＝6）Tab 4 Concentration of potassium ion in lymphocyte of rabbit（smmol·L－1，±s，n＝6）

與模型對照組比較：■P＜0.01；與氯化鉀組比較：★P＜0.01vs.model group：■P＜0.01；vs.KCl group：★P＜0.01

組別模型對照組氯化鉀組門冬氨酸鉀鎂組FDPK組淋巴細胞內鉀離子濃度23.86±2.1824.17±2.8929.80±2.09■★30.63±3.77■★劑量/50 mL·kg－1生理鹽水0.3%氯化鉀1.34%門冬氨酸鉀鎂0.98%FDPK

由表4可見，FDPK組和陽性藥物門冬氨酸鉀鎂組的淋巴細胞內鉀濃度比模型對照組、氯化鉀組均有明顯升高，有顯著性差異（P＜0.01），提示FDPK能促進鉀離子進入細胞內。

4 討論

缺血再灌注心律失常是缺血再灌注損傷的表現形式之一。臨床上冠心病患者的血流重建術后、冠脈痙攣或冠脈內血栓形成后自發性再灌注引起的致命性心律失常不容忽視，易引起猝死。本研究結扎大鼠冠狀動脈左前降支10 min，松開結扎線60 min，各組大鼠均出現室性心律失常，表明缺血再灌注心律失常模型建立成功[4，5]。同時，參照文獻[6]，由家兔耳緣靜脈給予呋塞米注射液，6 d后取血測定血清鉀濃度均低于3 mmol·L－1，表明也成功地建立了家兔低鉀血癥模型。

再灌注時室性心律失常發生機制目前尚未完全明了。一般認為其機制主要是：由于再灌注后心肌細胞損傷產生的氧自由基增多，心肌肌膜Na+-K+-ATP酶的活性降低，細胞內環境紊亂，導致心肌電不穩定性增加所致。FDP能在分子水平上調節細胞代謝中若干酶的活性，對多種器官和細胞損傷具有保護作用[9]。本實驗發現，FDPK能升高Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，提示FDPK具有維持缺血狀態下離子泵的功能的作用。心肌缺血時能量代謝發生障礙，ATP分解產生大量氧自由基。外源性FDP能增強糖酵解代謝，促進缺血心肌ATP生成和ATP循環，減少分解，從而減少氧自由基產生[9]。本實驗也證實，FDPK能降低心肌組織中MDA的含量，升高SOD的活性。

急性心肌缺血缺氧可造成胞內鉀的丟失和胞外鉀的集聚，對心律失常的發生起著重要作用[10]。Oshima T等[11]對心臟直視手術中取得的心肌標本進行淋巴細胞與心肌細胞內鉀的含量的測定，結果提示兩者高度相關。所以，近年來人們將淋巴細胞當作了解心肌細胞電解質含量的窗口。本實驗發現FDPK能直接升高低鉀血癥家兔淋巴細胞內鉀的濃度。推測FDPK也可以直接減輕心肌缺血再灌注時鉀的丟失，恢復細胞的極化狀態，穩定細胞膜的電位變化，起到抗心律失常的作用。本實驗也證實FDPK具有明顯的抗缺血再灌注心律失常的作用，優于FDP。

綜上所述，FDPK一方面可保護心肌肌膜Na+-K+-ATP酶的活性、減少氧自由基產生，另一方面可直接減輕心肌缺血再灌注時細胞內環境紊亂，增加心肌電穩定性，從而起到明顯的抗缺血再灌注心律失常的作用，值得進一步研究和開發。

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