環孢素A納米粒在小鼠體內的藥動學及組織分布Δ

房志剛，陳亞根，張健康，魏妙，張學農，2#（.蘇州大學藥學院，蘇州市 2523；2.蘇州利元醫藥科技有限公司，蘇州市 25002）

環孢素A（Cyclosporine A，CyA）為第3代強效免疫抑制劑，已成功應用于腎臟、肝臟和心臟等器官移植手術前、后機體的排斥反應和自身免疫性疾病的治療，自其臨床應用以來，CyA顯著改善了實體器官移植的近期存活率，在器官移植史上具有劃時代的意義。目前臨床上常用的CyA制劑，如新山地明微乳制劑（Neoral）含有增溶劑Cremophor EL，可刺激組胺釋放，引起超敏反應[1]。納米粒給藥系統以其獨特的吸收機制和藥物保護作用等，受到國內外科研工作者的廣泛關注，并取得了較為顯著的成果。因此，筆者制備了CyA納米粒（CyANP）給藥系統，所用載體材料為腸溶材料Eudragit S100。該制劑可將藥物定位輸送到小腸特定部位，有效減少胃腸道酶系對藥物的代謝作用，并促進藥物吸收，其在大鼠體內的相對生物利用度為162.1%[2]，并且由于不含增溶劑Cremophor EL，可顯著降低過敏反應。

同時，由于目前國內、外文獻對CyA-NP在體內組織分布的研究少有報道，大多研究其在動物體內的相對生物利用度。因此，本文以Neoral為參比制劑，對小鼠口服灌胃給藥后CyA-NP在小鼠體內的藥動學和組織分布做進一步研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；Vivaflow50超濾儀（10000Da聚砜醚濾膜，德國賽多利斯公司）；MS3 digital渦旋器（德國IKA公司）；低速大容量多管離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）；SHZ-82型恒溫振蕩箱（金壇富華儀器有限公司）。

CyA（批號：0608019（N），純度：＞99.3%）、內標環孢素D（CyD，含量：＞96.5%）均由福建科瑞藥業有限公司提供；Eudragit S100（德國R?hm公司）；Neoral（諾華制藥有限公司，批號：S0049，規格：每粒25 mg）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水系三蒸水。

1.2 動物

清潔級昆明種小鼠，♂，體質量18～24 g，蘇州大學醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（蘇）2007-0035。

2 方法與結果

2.1 CyA-NP的制備[3]

精密量取泊洛沙姆125 mg，加入125 mL蒸餾水溶解作為水相；另取CyA50 mg、200 mg Eudragit S100，加無水乙醇50 mL制成有機相；以7#骨髓穿刺針迅速將有機相注入以400 r·min－1轉速攪拌的水相中。注射完畢后繼續攪拌10 min，轉入60℃水浴中，攪拌3 h以揮發有機溶劑，即得CyA-NP膠體溶液，并進行相關的質量評價。

結果，CyA-NP的粒徑分布為單峰分布，粒徑分布范圍為22～100 nm，平均粒徑為（43.9±0.82）nm。包封率為（98.3±0.2）%，載藥量（23.9±0.1）%，回收率（97.3±0.3）%。

2.2 生物樣品中CyA的濃度測定

2.2.1 色譜條件。色譜柱：HYPERSIL-BDS C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇/水＝55∶45（1/1）；流速：1.3 mL·min－1；檢測波長：210 nm；柱溫：70 ℃；進樣量：20 μL。

在上述色譜條件下，取空白全血、含藥全血+CyD、空白心臟、含藥心臟組織勻漿液樣品+CyD進樣分析，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白全血；B.含藥全血+CyD；C.空白心臟；D.含藥心臟+CyD；1.CyA；2.CyDFig 1 HPLC chromatographyA.blank blood；B.blood sample+CyD；C.blank heart；D.heart sample+CyD；1.CyA；2.CyD

圖1結果表明，小鼠血液及各組織勻漿液中內源性物質基本上不干擾CyA和內標CyD的測定，處理過程未引入新的雜質，在此色譜條件下CyA和CyD達到基線分離。

2.2.2 生物樣品的處理方法[4]。取小鼠心臟、肝、脾、肺、腎各組織樣品，精密稱定，按10 mL·g－1加水，高速電動勻漿器勻漿后，制得組織勻漿液。精密吸取全血0.5 mL或組織勻漿1.0 mL置于15 mL具塞塑料離心管中，加入20 μg·mL－1的CyD溶液50 μL和180 mmoL·L－1鹽酸溶液1 mL，渦旋混合1 min，加乙醚5 mL，密塞，水平固定于恒溫振蕩器上，100 r·min－1振蕩15 min，4000 r·min－1離心15 min；分取醚層置于15 mL具塞塑料離心管中，加入1%偏重硫酸鈉2.5 mL和95 mmoL·L－1氫氧化鈉溶液1 mL，振蕩（4000 r·min－1）。分取無色醚層置于5 mL具塞玻璃離心管，40℃水浴中氮氣吹干，殘渣加乙腈-水（70∶30）150 μL，渦旋混合2 min；加正己烷1 mL，渦旋混合2 min，3500 r·min－1離心10 min，棄正己烷層，血樣重復2次，組織樣品重復3次，最后一次均用0.5 mL正己烷洗滌，取下層清液20 μL進樣。

2.2.3 標準曲線的制備。精密吸取空白全血0.5 mL或空白組織勻漿液1 mL，加入CyA系列工作液和CyD溶液各50 μL，使成濃度依次為0.05085、0.3051、0.5085、1.017、3.051、4.068、6.102 μg·mL－1的血樣及濃度依次為 0.2542、1.525、2.542、5.085、15.25、20.34 μg·g－1的組織樣品，按照“2.2.2”項下方法操作，進樣，記錄色譜及峰面積，以Ai（CyA與CyD的峰面積之比）對濃度C作線性回歸，得到線性方程，即為標準曲線，結果見表1。

表1 全血及組織中CyA的線性方程和線性范圍Tab 1 Regression equation and linear rang of CyA in blood and tissues

結果表明，在相應濃度范圍內，峰面積比與濃度呈良好的線性關系。

2.2.4 回收率與精密度。取空白血樣0.5 mL或組織勻漿液1.0 mL，加入濃度為3、10、30 μg·mL－1的CyA溶液50 μL，按“2.2.2”項下方法操作，記錄CyA與內標峰面積之比，以測得濃度與實際濃度之比計算方法回收率（%）。以生物樣品中CyA的峰面積與相同濃度CyA溶液進樣后峰面積之比計算提取回收率（%）。并計算日內及日間精密度（n＝5）。制備CyA在血液及各組織中的低、中、高濃度的生物樣品，考察生物樣本處理后室溫放置12 h內的穩定性。

結果，低、中、高濃度血液和各組織樣品的提取回收率均大于72%，方法回收率在78.68%～108.2%之間。血液和各組織的日內精密度小于8.6%（n＝5），日間精密度小于11.5%（n＝5）；生物樣品處理后室溫放置12 h內穩定，表明此方法符合生物樣品分析的要求。

2.3 給藥設計

取小鼠120只，隨機分為20組，每組6只。實驗前禁食12 h，自由飲水。前10組小鼠按25 mg·kg－1的劑量灌胃給予Neoral溶液，后10組灌胃給予等劑量的CyA-NP膠體溶液，于給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h摘眼球取血，置于以1%肝素抗凝的EP管中。隨即頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出心臟、肝、脾、肺、腎，洗去殘余血液，去除多余結締組織，濾紙吸干，稱重。所有樣品均置于－70℃保存備用。

2.4 血藥濃度和藥動學參數的測定

應用3p97藥動學處理程序，對小鼠口服Neoral和CyANP后全血的血藥濃度-時間數據進行處理，確定口服給藥后2種制劑均符合二室模型。Cmax、tmax為實測值，AUC采用梯形面積法計算。CyA-NP和Neoral中CyA的藥動學參數結果見表2。

2.5 CyA在小鼠體內的組織分布

CyA-NP和Neoral經小鼠口服灌胃后，以不同時間各組織中CyA的含量來評價2種制劑在小鼠體內的組織分布，其小鼠各組織分布直方圖見圖2。

表2 2種制劑藥動學參數結果（n＝6）Tab 2 Pharamacokinetic parameters of Neoral and CyANP（n＝6）

圖2 2種制劑口服后在小鼠體內的組織分布（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NPFig 2 Tissues distribution of Neoral and CyA-NP after oral administration（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NP

由圖2可見，0.5 h時CyA-NP在肝中的分布量為給藥量的4.19%，在血液中的分布量為給藥量的2.09%；而Neoral在肝中的分布量為給藥量的4.22%，在血液中的分布量僅為給藥量的1.12%。以Neoral為參比制劑，CyA-NP的相對生物利用度為162.5%。

2.6 靶向性評價

以靶向效率（Te），相對靶向效率（RTe）和靶向指數（TI）為評價指標，考察CyA-NP相對于Neoral的靶向性。由于靶與非靶組織的質量和容量相差較大，僅以AUC不能真實反映藥物向不同組織分布劑量的數據，因此引入AUC與各組織質量的乘積AUQ，能更全面地定量評價藥物靶向性參數，其中血液按總重的8%計算[5，6]。AUC、AUQ、Cmax和 tmax結果見表3；以Te、RTe、TI作為評價參數，結果見表4。

由表3、表4可見，CyA-NP在體內組織中藥物濃度分布趨勢為肝＞心臟＞腎＞脾＞肺，而Neoral為肝＞心臟＞脾＞腎＞肺；CyA-NP在體內藥物量分布趨勢為肝＞腎＞心臟＞肺＞脾，而Neoral為肝＞腎＞心臟＞脾＞肺；腎、心臟的相對靶向效率RTeAUC、RTeAUQ，靶向指數TIAUC、TIAUQ均大于1，而肝的靶向指數TIAUC、TIAUQ接近于1。

表3 2種制劑口服后CyA在血液及組織中的AUC、AUQ、Cmax和tmaxTab 3 AUC、AUQ、Cmaxand tmaxof CyA in blood and different tissues after oral administration

表4 2種制劑口服后CyA在血液及組織中的Te、RTe和TITab 4 Te，RTe and TI of CyA in blood and different tissues after oral administration

3 討論

CyA系一種強親脂性多肽，與血液中各組分都有較高的結合率，且受溫度影響較大，測定時溫度不易控制，故選擇測定全血已成為共識。目前國內、外CyA的體內測定方法主要有放射免疫法（RIA）、高效毛細管電泳法（HPCE）、熒光偏振免疫法（FPIA）和HPLC等[7，8]。前3種方法特異性差，多因受CyA代謝物的影響而使測定結果偏高；而HPLC法特異性強，測定結果不受代謝物的影響，且測定成本相對低廉。本文采用液-液萃取法對血樣及組織樣品進行處理，通過2次萃取、多次洗滌等步驟，去除了生物樣品中的雜質，避免了雜峰的干擾。藥物的保留時間在10 min以內，有利于大量樣品的測定。

與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后改變了CyA在體內的分布，使藥動學參數發生變化，其中V/f（c）變小，CL（s）降低，同時AUC明顯增大，體內生物利用度是Neoral的1.625倍。這可能由于口服給藥時納米粒可被胃腸道黏附，直接被攝取，或在特定部位釋放吸收所致。另外，CyA-NP的體外釋藥具有顯著的pH值依賴性，當pH＞6時，CyA能從粒子中迅速并完全釋放，這樣既能減少胃腸道酶系對藥物的代謝作用，又可在腸段特定部位吸收[3]。因此，在等劑量給藥條件下，CyA-NP有助于藥物的口服吸收。

組織分布研究結果表明，與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后改變了CyA在小鼠體內的分布。由圖2可知，2種制劑在肝中的分布量最大，其次為血液，并且CyA-NP在血液中的分布量高于Neoral。0.5 h時CyA-NP在肝中的分布量為給藥量的4.19%，在血液中的分布量為給藥量的2.09%，而Neoral在肝的分布量為給藥量的4.22%，在血液中的分布量僅為給藥量的1.12%，另外，血液靶向指數TIAUC、TIAUQ均大于1，表明CyA-NP對血液有明顯的濃聚作用；在除肺外的其它組織，藥物濃度達到高峰時的時間均相應提前，說明CyA-NP體內分布迅速，使血液及各組織中藥物濃度較快達到峰值。

從靶向參數TeAUC、TeAUQ來看，與Neoral給藥后比較，CyA-NP給藥后對腎和心臟有一定的趨向性，且不會在肝中蓄積；而對于脾和肺，CyA-NP減少了CyA在這些器官的分布。

CyA-NP能夠提高CyA的口服生物利用度，對腎和心臟的趨向性，預示著能夠提高腎、心臟移植患者的治療效果，并且與Neoral達到相同的治療效果時所用劑量比較，本品的劑量更低，故可降低毒副作用，同時提高臨床用藥水平。

[1]Luke DR，Kasiske BL，Matzke GR，et al.Effect of cyclosporin on the isolated perfused rat kidney[J].Transplantation，1987，43（6）：795.

[2]楊志強，潘 萍，許 潔，等.環孢素A-Eudragit S100納米粒的制備及其體內外評價[J].中國藥學雜志，2008，43（23）：1798.

[3]楊志強，許 潔，潘 萍，等.環孢素A-pH敏感性納米粒的制備工藝和體外釋藥特性[J].中國新藥雜志，2008，17（20）：1784.

[4]Li HS，Ye GQ，Zhao JL，et al.Improved high performance liquid chromatographic determination of cyclosporine A in whole blood samples of rat and rabbit[J].West China J Pharm Sci，1999，14（2）：89.

[5]張典瑞，任天池，婁紅祥，等.冬凌草甲素固態類脂納米粒在小鼠體內的組織分布及兔體內的藥代動力學[J].藥學學報，2005，40（6）：573.

[6]孫潔胤，周芝芳，劉 放，等.苦參素固體脂質納米粒的藥動學和體內分布[J].中國藥學雜志，2007，42（14）：1091.

[7]宋曉勇，張永州，王云香.HPLC法與熒光偏振免疫法檢測血樣中環孢素A濃度的比較研究[J].中國藥房，2007，18（23）：1788.

[8]曹勁慈，楊長青.RP-HPLC法測定腎移植患者全血中環孢素A的濃度[J].中國藥房，2007，18（23）：1790.