HPLC法同時(shí)測(cè)定Beagle犬血漿中茴三硫及其代謝物濃度的方法學(xué)研究

余佳芮，蔣學(xué)華（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶市 400014；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，成都市 610041）

茴三硫（Anethole trithione，AT）是臨床多年來(lái)常用的保肝利膽藥如膽維他、新旦維等的有效成分。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)該化合物還具有其他臨床新用途，如促進(jìn)唾液分泌、降低血脂、抗氧化作用等。但該藥在進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)后迅速代謝為對(duì)羥基苯基三硫酮（ATX）及其結(jié)合物，在血或尿中均測(cè)不到原型藥物而只能測(cè)到其代謝物。鑒于AT的上述特性，考慮到在Beagle犬給藥后出現(xiàn)類似情況的可能性較大，本文進(jìn)行了Beagle犬血漿中AT及其代謝物濃度同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜（HPLC）法的方法學(xué)考察。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能夠滿足濃度研究的要求。雖然在本文中沒(méi)有對(duì)犬給藥后的體內(nèi)生物樣品如血漿中的代謝物濃度進(jìn)行測(cè)定，但本方法可為體內(nèi)生物樣品的分析打下基礎(chǔ)。

1 材料

SPD-10AT HPLC儀，包括VP型泵、SPD-10AVP型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；ANASTAR色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)（天津Autoscience公司）；1712型電子天平（德國(guó)Sartorious公司）。

AT對(duì)照品（四川國(guó)嘉生物制藥股份有限公司，含量：99.7%）；ATX對(duì)照品（四川大學(xué)華西藥學(xué)院，含量：99.8%）；甲醇和乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

Beagle犬血漿（四川大學(xué)華西藥學(xué)院提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取AT對(duì)照品約28 mg、ATX對(duì)照品約17 mg，分別精密稱定，各置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得AT（280 μg·mL－1）和ATX（176 μg·mL－1）貯備液，置于4 ℃冰箱中保存，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

2.2 色譜條件

[1，2]并經(jīng)試驗(yàn)后確定色譜條件。色譜柱為迪馬公司Diamonsil ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20，V/V），柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL·min－1，測(cè)定波長(zhǎng)為346 nm。按選定的色譜條件，取Beagle犬空白血漿、AT和ATX對(duì)照品溶液、AT+ATX對(duì)照品溶液+空白血漿進(jìn)樣分析，色譜見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，犬血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響AT和ATX的分離測(cè)定，二者的保留時(shí)間分別為5.5、3.4 min。

2.3 樣品處理

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.AT對(duì)照品溶液+ATX對(duì)照品溶液；C.AT對(duì)照品溶液+ATX對(duì)照品溶液+空白血漿；1.ATX；2.ATFig 1 HPLC chromatographyA.blank plasma；B.AT reference substance and ATX reference substance；C.AT reference substance+ATX reference substance+blank plasma；1.ATX；2.AT

精密量取Beagle犬血漿樣品0.5 mL，加入乙腈1.0 mL，旋渦振蕩3 min，10000 r·min－1離心 5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下分離測(cè)定，分別記錄色譜圖、AT及ATX的峰面積，并分別用外標(biāo)法計(jì)算血漿中待測(cè)物質(zhì)濃度。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取犬空白血漿0.5 mL，分別加入不同濃度的含AT和ATX的對(duì)照品溶液，使犬血漿中AT的濃度分別為3.392、2.035、1.272、0.424、0.254 μg·mL－1，ATX的濃度分別為1.664、0.998、0.624、0.208、0.125 μg·mL－1，再分別加入乙腈1.0 mL，旋渦振蕩3 min，10000 r·min－1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下分離測(cè)定，記錄色譜圖、AT和ATX峰面積。以AT和ATX的峰面積A為縱坐標(biāo)，血漿中AT和ATX濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，分別得到AT和ATX的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。AT：A＝34.25×103C－852.28（r＝0.9999）；ATX：A＝39.75×103C－571.09（r＝0.9998）。表明犬血漿中AT檢測(cè)濃度在0.254～3.392 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，ATX檢測(cè)濃度在0.125～1.664 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。最低定量濃度AT為0.254 μg·mL－1，ATX為0.125 μg·mL－1。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別于0.5 mL犬空白血漿中加入高、中、低不同濃度的AT和ATX對(duì)照品溶液，混勻得到高、中、低不同濃度的AT和ATX犬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，計(jì)算出犬血漿中AT和ATX的濃度，以測(cè)得值與加入值之比分別計(jì)算兩者的回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery test（n＝5）

由表1可見(jiàn)，AT高、中、低濃度的平均回收率為（93.89±2.39）%，ATX高、中、低濃度的平均回收率為（96.28±2.83）%。

2.6 方法精密度

分別于0.5 mL犬空白血漿中加入高、中、低不同濃度的AT和ATX對(duì)照品溶液，混勻，得高、中、低不同濃度的AT和ATX犬血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別測(cè)定并計(jì)算AT和ATX的日內(nèi)與日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of precision test（n＝5）

由表2可見(jiàn)，AT高、中、低濃度的日內(nèi)RSD分別為0.88%、0.83%、4.11%，日間RSD分別為0.71%、1.87%、4.51%。ATX高、中、低濃度的日內(nèi)RSD分別為0.55%、0.87%、1.23%，日間RSD分別為1.74%、2.76%、3.92%。

2.7 穩(wěn)定性考察

取已知濃度的含有AT和ATX的犬血漿樣品數(shù)份，分別置于室溫、冷凍條件下存放不同時(shí)間后，按“2.3”項(xiàng)下處理與測(cè)定方法操作，分別測(cè)定AT和ATX的峰面積并計(jì)算濃度，考察犬血漿樣品在室溫（25℃）和冷凍（－20℃）條件下分別放置6 h、6 d后的穩(wěn)定性。另取不同濃度的犬血漿樣品經(jīng)2倍體積乙腈沉淀蛋白后的上清液，置于室溫（24～27℃）下存放不同時(shí)間（6 d），測(cè)定AT和ATX的濃度，考察犬血漿樣品乙腈沉淀蛋白后上清液室溫下放置的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of stability test

由表3可見(jiàn)，犬血漿樣品在室溫（25℃）下放置48 h，AT不夠穩(wěn)定，濃度顯著下降；ATX比較穩(wěn)定，濃度變化小于10%。犬血漿樣品在冷凍條件（－20℃）下放置6 d，AT不夠穩(wěn)定，濃度顯著下降；ATX也不夠穩(wěn)定，2 d內(nèi)濃度下降超過(guò)10%，2 d后濃度下降不明顯。犬血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后的上清液在室溫（24～27℃）下放置6 d，AT和ATX都比較穩(wěn)定。

3 討論

關(guān)于AT體內(nèi)代謝方面的研究報(bào)道較少，Gmelin等[3]用14C或35S進(jìn)行標(biāo)記，具體研究了AT在人、家兔和鼠體內(nèi)代謝的途徑。在人、家兔和鼠體內(nèi)，AT的Ⅰ相代謝產(chǎn)物相同，都是發(fā)生O-去甲基化反應(yīng)代謝生成ATX。ATX繼續(xù)發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)生成葡萄糖醛酸結(jié)合物（ATXK2）和硫酸結(jié)合物（ATXK1）后從尿中排出。AT的Ⅱ相結(jié)合反應(yīng)存在種屬差異，在家兔尿中，主要以ATXK1為主，ATXK2很少；在鼠尿中，主要為ATXK2，ATXK1僅以有限量存在；而在人尿中，ATXK2作為唯一的結(jié)合物存在而沒(méi)有ATXK1，此外還存在極少量未結(jié)合的ATX。

至于AT在Beagle犬體內(nèi)的體內(nèi)代謝，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。如果與在人、家兔或家鼠體內(nèi)的Ⅰ相代謝反應(yīng)相同而只是在3種代謝物的數(shù)量分布上有所不同，都可以通過(guò)本方法的進(jìn)一步改進(jìn)（如調(diào)整流動(dòng)相組成、在測(cè)定前加入相對(duì)應(yīng)的水解酶水解樣品等）進(jìn)行測(cè)定和研究。探討其具體可行性是筆者下一步研究的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]余佳芮，蔣學(xué)華，楊俊毅.HPLC測(cè)定人血漿中茴三硫濃度[J].藥物分析雜志，2005，25（8）：970.

[2]丁玉峰，謝 斌.反相高效液相色譜法測(cè)定茴三硫片中茴三硫的含量[J].中國(guó)藥師，2008，11（10）：1176.

[3]Gmelin R，Lagler F.Vertr?glichkeit und Ausscheidung von Anethotrithion[J].Arzneim Forsch，1963，13（2）：130.