青藤堿腸溶片在Beagle犬體內藥動學研究

陳萬一，何海霞，李秋波，馮曉科，康紀平，周遠大（1.重慶市腫瘤研究所，重慶市 40000；.重慶醫科大學附屬第一醫院臨床藥理研究室，重慶市 400016；.四川省養麝研究所，都江堰市 61180）

青藤堿（Sinomenine）具有抗炎、鎮痛、解熱和免疫調節[1]的作用。青藤堿腸溶片臨床上用于治療類風濕關節炎，療效較好[2]。其在大鼠、家兔體內的藥動學研究已有報道[3，4]，而在Beagle犬體內藥動學研究尚未見文獻報道。為此，本文建立了以高效液相色譜（HPLC）法測定青藤堿腸溶片給藥后在Beagle犬體內血藥濃度的方法，并進行了藥動學研究。

1 材料

1.1 儀器

1100 HPLC儀（美國Agilent公司）；pHS-3C酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；VXH-3型快速混合器（上海躍進醫療器械廠）；B160A型醫用低速離心機（河北省安新縣白洋離心機廠）；BP61型電子天平（德國Startorious公司）。

1.2 試藥

青藤堿腸溶片（商品名為正清風痛寧片，西安利君制藥有限責任公司，批號：0707291，規格：每片20 mg）；內標去水嗎啡注射液（沈陽第一制藥廠，批號：20020613，規格：5 mg∶mL－1）；青藤堿對照品（西安賽邦醫藥科技有限公司，批號：20070402，純度：98%）；二氯甲烷為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康Beagle犬8只，體質量（10±0.8）kg，♀♂各半，四川養麝研究所提供，質量合格證號和環境設施合格證號分別為川實動管第63號和第64號。

2 方法與結果

2.1 血藥濃度測定方法的建立

2.1.1 色譜條件。色譜柱為Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.01 mol·L－1磷酸二氫鈉-三乙胺（55∶45∶0.1，調pH至7），流速為0.8 mL·min－1，內標為去水嗎啡，檢測波長為262 nm，柱溫為30℃，進樣量為50 μL。

2.1.2 專屬性試驗。在選定的色譜條件下，取青藤堿對照品+內標溶液、空白血漿、空白血漿+青藤堿對照品+內標及Beagle犬給藥1 h后血漿樣品，進樣分析，色譜見圖1。

由圖1可見，青藤堿與內標峰形尖銳，與血漿中內源性物質及其它雜質分離良好，保留時間分別為10、13 min。

2.1.3 青藤堿對照品溶液制備。精密稱取青藤堿對照品適量，用甲醇溶解并定容，制備成300 μg·mL－1的貯備液，于4 ℃保存。臨用前，用犬空白血漿按倍數稀釋法稀釋至所需濃度，即得青藤堿的標準工作液。

2.1.4 內標溶液制備。取1支去水嗎啡注射液，加甲醇制備成200 μg·mL－1的貯備液，于4 ℃保存。臨用前，加水稀釋成40 μg·mL－1，即得內標工作液。

2.1.5 樣品處理。取血漿樣品0.4 mL，加入內標50 μL（40 μg·mL－1），混合均勻，加入二氯甲烷4 mL，漩渦混勻1 min后3500 r·min－1離心5 min，靜置分層。取二氯甲烷層清液，50℃水浴中氮氣吹干，流動相100 μL復溶，每次進樣50 μL。

圖1 高效液相色譜圖A.青藤堿對照品+內標；B.空白血漿；C.空白血漿+青藤堿對照品+內標；D.血漿樣品；1.青藤堿；2.內標Fig 1 HPLC chromatographyA.sinomenine control+internal standard；B.blank plasma；C.blank plasma+sinomenine control+internal standard；D.plasma sample；1.sinomenine；2.internal standard

2.1.6 標準曲線、線性范圍和最低定量濃度。分別取青藤堿貯備液適量及犬空白血漿，制成濃度為90、45、22.5、4.5、0.45、0.045、0.0075 μg·mL－1的青藤堿血漿樣品，按“2.1.5”項下方法處理，進樣，所得數據以血漿中青藤堿的濃度X對青藤堿與內標的峰面積比值Y進行線性回歸，得血漿中青藤堿的標準曲線為Y＝0.3920X+0.7052（r＝0.9991）。結果表明，青藤堿檢測濃度在0.0075～90 μg·mL－1范圍內線性關系良好，最低定量濃度為0.0075 μg·mL－1（RSD＝9.23%，n＝5）。

2.1.7 回收率和精密度。取青藤堿貯備液適量及犬空白血漿，制成高、中、低濃度（45、4.5、0.045 μg·mL－1）樣品，按“2.1.5”項下方法處理，評價本法的方法回收率與萃取回收率（含藥血漿經樣品處理所得測定值與同時用流動相配制的同濃度標準溶液測定值計算萃取回收率）及日內精密度（每個濃度同日內測定5次）、日間精密度（每個濃度連續測5 d，每天測1次），結果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結果（n＝5）Tab 1 Recovery rate and precision tests（n＝5）

2.2 給藥及血藥濃度測定

選取8只Beagle犬，♀♂各半，實驗前禁食12 h后，根據臨床人用劑量，于次日晨8時空腹灌服10 mg·kg－1青藤堿腸溶片，分別于給藥后0、15、30、60、90、120、240、480 min，從前肢靜脈取血2 mL，分離血漿，按“2.1.5”項下方法處理進樣，以青藤堿峰面積與內標峰面積之比值代入標準曲線方程計算血藥濃度，平均藥-時曲線見圖2。

2.3 藥動學參數

采用3p97計算機軟件選擇最佳房室模型，結果Beagle犬按10 mg·kg－1量口服青藤堿腸溶片后在體內的血藥濃度-時間曲線經擬合后為一室開放模型，計算求得其藥動學參數見表2。

圖2 犬單劑量口服10 mg·kg－1青藤堿腸溶片后的平均血藥濃度-時間曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves in dogs after administration of single oral dose of 10 mg·kg－1sinomenine enteric tablets

表2 青藤堿腸溶片在犬體內的藥動學參數（n＝8）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of sinomenine enteric tablets in dogs（n＝8）

3 討論

在文獻[5，6]報道的測定青藤堿濃度的HPLC法中，主要采用氨基比林或者氯霉素作為內標，但在本實驗室條件下，效果均不理想。筆者經多次預試驗及改進[3]，最終采用去水嗎啡為內標，選取流動相甲醇-0.01mol·L－1磷酸二氫鈉的比例為55∶45，結果取得了良好的分離分析效果。

已有文獻[2～4]報道了口服青藤堿后在大鼠、家兔體內的藥動學參數，本實驗研究結果表明，Beagle犬服用青藤堿腸溶片后血藥濃度迅速升高，血藥濃度-時間曲線經擬合后符合一室開放模型，且根據CL/F（s）值（（0.36±0.12）L·min－1）和tmax值（（69.66±16.41）min），提示本品吸收及消除均較快，為其臨床用藥提供了依據。

[1]孔慶峰，李 軍.青藤堿凝膠的制備及質量控制[J].中國中藥雜志，2005，30（20）：1573.

[2]陳順樂，鮑春德，陳湘君，等.利君正清風痛寧片治療類風濕關節炎的療效觀察[J].中國藥房，2000，11（3）：126.

[3]張斯漢，周遠大，何海霞.正清風痛寧腸溶片的生物等效性研究[J].中國中藥雜志，2008，33（6）：684.

[4]劉啟德，梁美蓉，歐衛平，等.青藤堿時辰藥代動力學研究[J].中藥新藥與臨床藥理，1995，6（1）：24.

[5]楊廣德，劉軍保，王志軍，等.反相高效液相法測定血漿中青藤堿的含量[J].中國藥學雜志，1993，28（3）：152.

[6]張先洲，周延安，羅順德，等.青藤堿凝膠劑的質量標準研究[J].醫藥導報，2003，22（8）：571.