光誘導金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究

王曉利， 王彩虹，2， 郭 懿， 王金林， 張俊松*

（1.深圳職業技術學院，廣東 深圳518055；2.華南理工大學，廣東 廣州510006；3.復旦大學，上海 200433）

光誘導金絲桃素對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡研究

王曉利1， 王彩虹1，2， 郭 懿3， 王金林1， 張俊松1*

（1.深圳職業技術學院，廣東 深圳518055；2.華南理工大學，廣東 廣州510006；3.復旦大學，上海 200433）

金絲桃素；光動力治療；發光二極管；鼻咽癌；凋亡

目的：探討以發光二極管為光源，金絲桃素光動力療法對體外培養鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用和凋亡影響。方法：體外培養CNE-2細胞分別加入不同濃度的金絲桃素，另設血卟啉陽性對照組，避光培養6 h，分別用黃色和紅色發光二極管照射90 min，積累能量為5.67 J/cm2，培養24 h后用MTT法檢測金絲桃素和血卟啉在光照條件下對鼻咽癌細胞CNE-2的影響，并用流式細胞儀進行細胞周期分析和凋亡檢測。結果：MTT結果顯示光活化金絲桃素和血卟啉呈劑量依賴性抑制鼻咽癌細胞的生長，IC50分別為0.049和0.650 μg/mL；流式細胞儀分析表明金絲桃素經光照后，可使細胞停留在S期和G2期，并誘導細胞凋亡，0.20 μg/mL金絲桃素作用18、28、48 h，凋亡率分別達到9.97%、72.19%、92.24%。結論：金絲桃素經光誘導后，可有效抑制體外培養鼻咽癌細胞的增殖，并誘導鼻咽癌細胞凋亡。

金絲桃素（Hypericin，HY）是貫葉金絲桃（Hypericum perforatum L.）中最具生物活性的物質，屬萘并二蒽酮類，具有抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤活性。光照條件下，金絲桃素能吸收光子，激發產生單線態氧，破壞細胞膜等，抑制腫瘤細胞生長，即具有光動力活 性［1］。光 動 力 療 法 （photodynamic therapy，PDT）是隨著光纖技術、激光醫學和內鏡技術發展而興起的一種治療腫瘤的新方法，近二十年來，PDT開始進入臨床試驗，用于頭、頸、腦、肺、胰腺、腹腔、胸、前列腺和皮膚等腫瘤的治療，其中光敏劑和光源的選擇是光動力治療中的關鍵和核心問題。早期的光敏劑大多是卟啉類衍生物（如血卟啉、光敏素），存在很多不足之處，比如對皮膚有長時光毒性、對腫瘤組織選擇性低等［2］。金絲桃素具有與腫瘤親和性高及毒副作用較低等特點，是一種比較理想的光敏劑。鼻咽癌是東南亞及我國南方各省常見的一種惡性腫瘤，嚴重危害東南亞及我國南方人民的身心健康。本文以LED為光源，金絲桃素為光敏劑對人鼻咽癌細胞CNE-2的毒作用及凋亡進行了研究探討。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人鼻咽癌CNE-2細胞株為南方醫科大學病理研究室惠贈。

1.2 藥品與試劑

金絲桃素（Hypericin，HY）（美國Alexis公司）；RPMI1640培養基（美國 Gibco公司）；胰蛋白酶-0.25%EDTA（美國Gibco公司）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國 Sigma公司）、血卟啉（Hematoporphyrin，HP）（美國Sigma公司）；Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit、Apo-BRDUTMKit（美國 Becton Dickinson 公司）；其余試劑為分析純。

1.3 儀器

FACSCalibur流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；Spectramax M2光密度熒光檢測儀（美國Molecular Devices公司）；LED光源（深圳佳進光電技術有限公司）；二氧化碳孵箱（德國Binder公司）；倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；TQ8210型光纖功率計（日本愛德萬公司）；微孔細胞培養板（美國Corning公司）。

1.4 細胞培養

CNE-2細胞于37℃、5%CO2、相對飽和濕度條件下，在含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中傳代培養，試驗所選用細胞均處于對數生長期。

1.5 腫瘤細胞的生長抑制率測定（MTT法）

調整細胞濃度為105個/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL，輕輕混勻，置二氧化碳孵箱中培養24 h，細胞覆蓋率為70%左右。光照組和避光組，分別加入終濃度為 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg/mL的金絲桃素，設只加溶劑DMSO的空白對照和血卟啉陽性對照組，陽性對照組加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μg/mL 的血卟啉。避光培養6 h后，將黃光LED光源置于金絲桃素光照組正上方2 cm處，紅光LED光源置于陽性對照組正上方2 cm處，用光纖功率計調整光源功率密度為1.05 mW/cm2，照射90 min，積累能量約5.67 J/cm2后繼續培養20 h，吸去培養液，PBS（pH7.4）漂洗1次，加入100 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT無血清培養基，繼續避光培養4 h，小心吸去培養液，加入DMSO∶無水乙醇為1∶1的混和液100 μL溶解甲臜，振蕩15 min，用Spectramax M2光密度熒光檢測儀（波長570 nm）測定各孔吸光值A570，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（Inhibition Rate，IR）% =（1－實驗組A570平均值/對照組A570平均值）×100。Bliss方法［3］計算半數抑制濃度IC50。

1.6 細胞周期檢測

將對數生長期的人鼻咽癌細胞株CNE-2于二氧化碳孵箱中培養24 h，分設0.20 μg/mL金絲桃素光照組、0.20 μg/mL金絲桃素不光照組和不加藥不光照三個組，避光培養6 h，將黃光LED光源置于培養孔正上方2 cm處，照射90 min，積累能量約5.67 J/cm2后繼續培養20 h，吸去培養液，PBS漂洗1次，胰酶消化，300 g離心5 min，PBS漂洗1次，離心后收集細胞，按Cycle TESTTMPLUS DNA Reagent Kit說明書處理細胞，FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 細胞凋亡檢測

分別收集0.20 μg/mL金絲桃素作用下培養18、28、48 h的加藥光照、加藥不光照組細胞，按Apo-BRDUTMKit說明書處理樣品，FACSCalibur流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.8 統計分析

實驗數據采用SPSS13.0統計軟件進行數據處理，各組間均數采用t檢驗，結果以±s表示。

2 結果

2.1 金絲桃素對CNE-2細胞的毒作用

光照條件下，不同濃度的金絲桃素對CNE-2細胞的生長抑制率與空白對照組比較有極顯著差異（P<0.01）。當金絲桃素的濃度為0.16 μg/mL時，對CNE-2細胞的生長抑制率達到90%以上，再增加金絲桃素濃度，抑制率無明顯升高，結果見表1。避光條件下，單純給予金絲桃素，對CNE-2細胞生長有一定的抑制作用，結果見表2，但相同濃度下，光照組與避光組間存在極顯著差異（P<0.01），金絲桃素光照給藥組呈明顯的劑量依賴性，避光組的細胞抑制率明顯低于光照組，見圖1。光照條件下，金絲桃素對CNE-2細胞的 IC50為0.049 μg/mL，血卟啉對CNE-2細胞生長也有明顯的抑制作用（P<0.01），見表 3，但其 IC50為 0.650 μg/mL，明顯高于金絲桃素。

表1 光照條件下金絲桃素對CNE-2細胞的生長抑制作用（±s，n=8）

表1 光照條件下金絲桃素對CNE-2細胞的生長抑制作用（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P<0.01。

組別 HY濃度/（μg/mL） A570 0.932±0.029 0金絲桃素 0.04 0.536±0.021 42.5*0.08 0.286±0.023 69.4*0.12 0.146±0.010 84.4*0.16 0.089±0.011 90.4*0.20 0.062±0.012 93.3 IR/%對照*

表2 避光條件下金絲桃素對CNE-2的生長抑制作用（ˉx ± s，n=10）

圖1 HY對CNE-2的生長抑制作用

表3 光照條件下血卟啉對CNE-2的生長抑制作用（ˉx ±s，n=6）

2.2 金絲桃素對細胞周期的影響

流式細胞儀測定結果表明加藥光照組G1期細胞比率較加藥不光照組和不加藥不光照組明顯降低，S期和G2期的比率明顯升高。見表4和圖2。

表4 金絲桃素對CNE-2細胞周期的影響

2.3 金絲桃素對細胞凋亡的影響

流式細胞儀分析結果表明，加藥不光照的細胞只出現少量凋亡細胞，隨著加藥孵育時間的延長，凋亡率逐漸增大，到48 h達到22.37%；而加藥光照組在28 h時凋亡率已可達72.19%，延長至48 h可達92.24%，明顯高于非光照組，見表5和圖3。

圖2 金絲桃素對CNE-2細胞周期的影響圖

圖3 金絲桃素對CNE-2細胞凋亡的影響

表5 金絲桃素對CNE-2細胞凋亡的影響

3 討論

MTT法是用于檢測細胞生長和細胞毒作用的可靠方法之一，不僅可以發現有效的抗腫瘤藥物，還可以為細胞水平和分子水平的抗腫瘤作用機制研究提供可靠的實驗數據［4］。本文通過MTT法檢測觀察到光誘導金絲桃素呈劑量依賴性抑制體外培養CNE-2細胞的增殖。

血卟啉的主要副作用為光過敏，在體內潴留長達4周左右，此間患者須避免光照，較高濃度血卟啉可加重光過敏反應。從上述試驗結果可知，血卟啉的IC50值為0.650 μg/mL，是金絲桃素IC50值0.049 μg/mL的13倍多，金絲桃素用藥后避光時間短，藥物作用濃度低，副作用較血卟啉小，是一種較理想的光敏劑。

細胞周期中，S期是DNA合成期，G1和G2期為DNA合成前、后間期，無DNA的合成，但有RNA和蛋白質的合成。當DNA堿基受損時，細胞阻滯在G1期；當DNA雙鏈斷裂時，細胞被阻滯在G2期。若在DNA復制不完全時，則M期激活因子活化抑制，在S期阻斷細胞周期［5］。大量研究表明：S期是化療藥物敏感時期，藥物可以通過影響DNA合成中所需的酶，或直接作用于DNA單鏈模板的活性部位，抑制DNA合成，將細胞阻滯于S期，從而抑制腫瘤細胞的生長。本實驗通過流式細胞儀分析發現金絲桃素光照組處理的細胞與其他兩組對照比較，其S期和G2細胞比例明顯升高，作用機制可能與影響DNA的合成及復制有關。

隨著細胞凋亡分子機制研究不斷深入，人們發現細胞凋亡信號通路主要有兩條［6-7］：即細胞凋亡的線粒體依賴性途徑和死亡受體途徑。有研究表明線粒體不僅是新型光敏劑金絲桃素優先定位的靶標，也是光動力損傷最先打擊的靶點［8］，它作用于細胞線粒體，使線粒體釋放細胞色素C，使細胞內的DNA片段和細胞的形態發生變化［9-10］。上世紀90年代初，國內外學者發現有些細胞的凋亡存在特異性，表現為不同因素誘導的凋亡發生在細胞周期的不同時相［11］。這類細胞凋亡，往往是細胞先被阻滯在細胞周期的某一時相，再發生細胞凋亡。本文通過流式細胞儀分析，結果表明金絲桃素光照組的凋亡率隨時間延長而明顯增大，給藥28 h達72.19%，48 h達92.24%，明顯高于金絲桃素非光照組，說明金絲桃素光照后，其對CNE-2細胞的生長抑制作用明顯增加。這與以往文獻報道金絲桃素無論在黑暗或光照條件下，都具有抑制腫瘤細胞生物活性作用相符［12］，只是單獨應用時需要高劑量金絲桃素。許川山等［13］用石英鹵素燈作為光源，在590 nm波長條件下進行CNE-2細胞的凋亡研究，也得到凋亡率為53.08%的類似結果。

LED是近年來使用的一種新型光源，亮度高、功率小、壽命長，可組裝成各種幾何形狀，有著普通光源不可比擬的優點。目前開發的LED光譜峰的半寬最窄已可達十幾納米以下，可供選擇的波長范圍覆蓋整個可見光區，能滿足不同的波長需求，其發光強度也完全可以滿足一般的臨床低強度治療需要。因此，無論在波長、實用性和價格方面，LED都不遜色于激光器甚至更有優勢［14］。國外已有人將LED光源應用于腫瘤的PDT研究，如美國的研究人員用LED光源進行腦腫瘤光動力治療的臨床試驗已取得了良好效果［15］，所用光源的機械性能比激光和其他光源更為可靠。可見，用LED光源代替激光器進行生命科學研究具有廣闊的應用前景。本文以金絲桃素為光敏劑，以LED作為PDT光源，試驗結果表明光誘導金絲桃素對體外培養的鼻咽癌細胞CNE-2有明顯抑制和誘導凋亡的作用，為鼻咽癌的體內研究和臨床治療提供了理論依據。

［1］Hudson J B，Harris L，Towers G H.The importance of light in the anti-HIV effect of hypericin ［J］.Antiviral Res，1993，20（2）：173-179.

［2］Wolford S T，Novicki D L，Kelly B.Comparative skin phototoxicity in mice with two photosensitizing drugs：benzoporphyrin derivative nonoacid ring A and porfimer sodium（photofrin）［J］.Fundam Appl Toxicol，1995，24（1）：52-56.

［3］孫瑞元.定量藥理學［M］.北京：人民衛生出版社，1987，169-176.

［4］Brezicka F，Einbeigi Z，Bergman B.Functional assessment in vitro of human-complement antibody-induced cytotoxicity of neoplastic cells［J］.Cancer Immunol Immunother，2000，49：235-242.

［5］劉愛林，余日安，魯文清.3-氯-4-二氯甲基-5-羥基-2（5氫）呋喃酮對L-02細胞增殖周期和凋亡的影響［J］.癌癥·畸變·突變，2005，17（6）：340-342.

［6］Green D R.Apoptotic pathways：paper wrap s stone blunts scissors［J］.Cell，2000，102（1）：1-4.

［7］Green D R，Reed J C.Mitochondria and apoptosis［J］.Science，1998，281（8）：13909-13921.

［8］Sun X，Leungw N.Photodynamic therapy with pyropheophorbideamethyl ester in human lung carcinoma cancer cell：efficacy，localization and apoptosis［J］.Photochem Photobiol，2002，75（6）：644-651.

［9］Kaufmann T，Borner C，Sieeman JP，et al.Inhibition of tumor cell growth by hyperforin，a novel anticancer drug from St.John′s wort that acts by induction of apoptosis［J］.Oncogene，2001，21（8）：1242-1250.

［10］Schempp C M，Simon-Haarhaus B，Termeer C C，et al.Hypericin photo induced apoptosis involves the tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand（TRA IL）and activation of caspase-8［J］.FEBS Lett，2001，493（1）：26-30.

［11］Gong J，Li X，Darzynkiewicz Z，et al.Different patters of apoptosis of HL-60 cells induced by cyclobeximide and camptothecin［J］.Cell Physiol，1993，157：263-270.

［12］Thomas C，Pardini RS.Oxygen dependence of hypericin-induced phototoxicity to EMT6 mouse mammary carcinoma cells［J］.Photochem Photobiol，1992，55：831-837.

［13］許川山，梁榮能.金絲桃素光動力作用誘導人鼻咽癌細胞凋亡［J］.激光技術，2005，29（4）：395-397.

［14］劉 江，范廣涵，劉承宜.改進實用型 LED生物光源系列［J］.應用激光，2003，23（3）：147-151.

［15］中 太.采用發光二極管治療腦腫瘤［J］.中國醫療器械雜志，2000，24（1）：60.

Photocytotoxic and apoptosis of hypericin-mediated on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro

WANG Xiao-li1， WANG Cai-hong1，2， GUO Yi3， WANG Jin-lin1， ZHANG Jun-song1*
（1.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，China；2.South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；3.Fudan University，Shanghai 200433，China）

hypericin；photodynamic therapy；light emitting diode；nasopharyngeal carcinoma；apoptosis

AIM：To study effects of hypericin associated with light emitting diode irradiation on nasopharyngeal carcinoma cell line of human in vitro.METHODS：CNE-2 cells were exposed respectively to different concentra-tion of hypericin，and compared with hematoporphyrin as positive control group，and incubated for 6 h in the dark，then accumulative radiated energe of yellow and red light irradiation equivalent to 5.67 J/cm2were given throughout 90 min，killing effect and apoptosis of CNE-2 cells were detected by MTT assay after incubation of 24 h and flow cytometry.RESULTS：MTT assay showed that cytotoxicity of hypericin and hematoporphyrin with light irradiation presented in dose-dependent way，their IC50values were 0.049 and 0.650 μg/mL，respectively.Flow cytometry showed that hypericin with light irradiation could block cell growth at S phase and G2phase，when CNE-2 cells were exposed to hypericin at 0.20 μg/mL for 18，28 and 48 h，the apoptosis rate reached at 9.97%，72.19%and 92.24%.CONCLUSION：Hypericin with light irradiation could obviously inhibit the growth of CNE-2 cells and induce apoptosis.

R285.6

A

1001-1528（2010）08-1296-05

2009-11-13

深圳市科技和信息局科技基金項目（06KJP038）

王曉利（1964－），女，教授，從事抗腫瘤藥物及其機理研究。Tel：（0755）26019267

*通訊作者：張俊松，男，教授，Tel：（0755）26019366 E-mail：junsongzhang@yahoo.com.cn