冠脈通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳金偉， 何宇新*， 陳慧娟

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所，四川成都 610031）

冠脈通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

吳金偉1， 何宇新1*， 陳慧娟2

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都610039；2.四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所，四川成都 610031）

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；高效液相色譜；淫羊藿苷

目的：建立冠脈通顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：用薄層色譜法對(duì)處方中的丹參、黃芪、紅花、五味子、赤芍進(jìn)行定性鑒別。用高效液相法測(cè)定制劑中淫羊藿苷的含量。結(jié)果：在薄層色譜中能檢出丹參、黃芪甲苷、紅花、五味子、赤芍，淫羊藿苷在

冠脈通顆粒為四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所主持研發(fā)的第六類新藥，由淫羊藿、丹參、黃芪、紅花、五味子、赤芍、太子參、當(dāng)歸、川芎、桂枝等十味中藥提取加工而成，具有活血化瘀、補(bǔ)血通經(jīng)、清熱涼血等功效，能明顯抑制心肌收縮力，降低心肌耗氧量，降低外周阻力，降低心臟負(fù)荷，主要用于治療冠心病。本試驗(yàn)對(duì)制劑中的丹參、黃芪、紅花、五味子、赤芍進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并對(duì)太子參、當(dāng)歸、川芎、桂枝的鑒別作了考察，發(fā)現(xiàn)陰性樣品有干擾。含量測(cè)定研究用HPLC法測(cè)定制劑中淫羊藿苷的含量，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20型高效液相色譜儀，主要組成部分為L(zhǎng)C-20AB型泵、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A紫外檢測(cè)器；VARIAN-100型紫外可見分光光度計(jì)；2F-2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；BT 423S型電子天平（Sartorius）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；Milli-Q Academic超純水儀（密理博中國(guó)有限公司）。

1.2 材料 冠脈通顆粒樣品由四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所提供；對(duì)照藥材和對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，五味子對(duì)照藥材（120922-200606）；丹參對(duì)照藥材（120923-200509）；赤芍（芍藥）對(duì)照藥材（121093-200402）；紅花對(duì)照藥材（120907-200609）；黃芪甲苷化學(xué)對(duì)照品（110781-200613）；淫羊藿苷化學(xué)對(duì)照品（110737-200414）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 鑒別

2.1 丹參的鑒別［1］取本品5 g，加0.2%鹽酸溶液60 mL，水浴回流4 h，放冷，過(guò)濾，取濾液30 mL，加NaCl 6 g，振搖使溶解，然后用乙酸乙酯萃取3次，第1次30 mL，第2次和第3次20 mL，合并乙酸乙酯，水浴揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材1 g和丹參陰性樣品5 g，同法制成丹參對(duì)照藥材溶液和丹參陰性溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-丙酮-甲酸（10∶4∶1.5）展開，取出晾干，先用氨蒸汽熏10 min，再噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，100℃烘干，待顯色清晰。

2.2 黃芪的鑒別［2］取本品16 g，加甲醇40 mL，超聲處理20 min，過(guò)濾，濾液加于中性氧化鋁柱（100～200目，16 g，內(nèi)徑10～15 mm）上，用40%甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，水浴濃縮至30 mL，用水飽和正丁醇振搖萃取2次，第1次30 mL，第2次20 mL，合并正丁醇液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃芪陰性樣品16 g，同法制成陰性供試品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇配置成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10）下層液展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至顯色清晰。

2.3 紅花的鑒別［3］取本品3 g，加80%丙酮20 mL，超聲處理10 min，靜置，取上清液，作為供試品溶液。另取紅花對(duì)照藥材1 g和紅花陰性樣品3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液和紅花陰性溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（7∶0.4∶2∶3）展開，取出晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視。

2.4 五味子的鑒別［4］取本品20 g，加甲醇40 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，水浴揮干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取2次，第1次30 mL，第2次20 mL，合并乙酸乙酯，水浴濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取五味子對(duì)照藥材1 g和五味子陰性樣品20 g，同法制成對(duì)照藥材溶液和五味子陰性溶液。吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（20∶2∶2∶0.5）展開，展距18 cm，取出晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。

2.5 赤芍的鑒別［5］取本品16 g，加無(wú)水乙醇50 mL，浸泡15 min后，超聲處理10 min，過(guò)濾，濾液揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取赤芍對(duì)照藥材1 g和赤芍陰性樣品16 g，同法制成赤芍對(duì)照藥材溶液和赤芍陰性溶液。吸取上述3種溶液各12 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇（5∶1）展開，取出晾干，噴5%硫酸香草醛溶液，105℃加熱至顯色清晰。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（31 ∶69）；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。結(jié)果表明，該色譜條件下，樣品色譜峰中，淫羊藿苷峰形對(duì)稱，淫羊藿苷與其它組分基線分離較好，分離度大于1.5；理論塔板數(shù)（N）按淫羊藿苷峰計(jì)算，大于2 000，且淫羊藿陰性樣品無(wú)干擾。見圖1～3。

圖1 淫羊藿苷對(duì)照品

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 將淫羊藿苷對(duì)照品甲醇溶液在200～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在270 nm處有最大吸收，故確定270 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖2 供試品溶液

圖3 淫羊藿陰性對(duì)照溶液

3.3 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，加甲醇20 mL，水浴回流1 h，過(guò)濾，用適量甲醇洗滌濾渣，合并濾液，水浴揮干。殘?jiān)铀?0 mL溶解，移入分液漏斗中，用10 mL水飽和正丁醇洗滌蒸發(fā)皿，并一起倒入分液漏斗。用水飽和正丁醇振搖萃取3次，每次20 mL，合并水飽和正丁醇，水浴揮干，殘?jiān)眉状挤?次洗滌，最后定容至25 mL，即得供試品溶液。

3.4 對(duì)照品溶液的制備 取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成0.021 6 mg/mL即可。

3.5 陰性對(duì)照溶液的制備 取淫羊藿陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

3.6 線性范圍 取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、8、16 μL，測(cè)定其峰面積。以峰面積值（A）對(duì)進(jìn)樣量（C）進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=2 312 554.70X－2 711.13；r=0.999 9。結(jié)果表明在0.021 6 μg～0.345 6 μg范圍內(nèi)，淫羊藿苷進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

3.7 進(jìn)樣精密度 取對(duì)照品溶液，每次進(jìn)樣5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得淫羊藿苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.24%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液（0.021 6 mg/mL）和供試品溶液，分別在 0、6、12、24、48 h 進(jìn)樣 5 μL，測(cè)定淫羊藿苷的峰面積。對(duì)照品溶液峰面積RSD值為1.20%，供試品溶液中淫羊藿苷峰面積RSD值為1.55%。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（090507），按供試品溶液的制備方法，制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定其中淫羊藿苷的峰面積，淫羊藿苷平均含量為1.027 mg/g，RSD值為0.82%。結(jié)果表明，采用該方法提取和檢測(cè)，重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量（0.987 mg/g）的同一批樣品6份，按《中國(guó)藥典》2005版附錄項(xiàng)下測(cè)定加樣回收率，平均回收率99.82%，RSD值為0.70%，見表1。結(jié)果表明，供試品溶液的制備及測(cè)定方法專屬性好，合理可行。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

3.11 樣品的含量測(cè)定 取不同批號(hào)的3批樣品，按擬定的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得3批樣品中淫羊藿苷含量分別為0.987 mg/g、1.013 mg/g、1.045 mg/g。

表2 樣品的含量測(cè)定（n=3）

4 討論

由于處方較復(fù)雜，各種藥材所含的成分相同或相似，故在定性鑒別中沒有制定太子參、當(dāng)歸、川芎、桂枝的鑒別方法，但試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)陰性溶液有干擾。

含量測(cè)定中，分別對(duì)流動(dòng)相的比例、提取方法、提取時(shí)間、進(jìn)行了考察。在提取時(shí)間為1 h超聲提取時(shí)，測(cè)得淫羊藿苷含量為0.906 mg/g，回流提取時(shí)，測(cè)得淫羊藿苷含量為0.986 mg/g。分別在0.5、1.0、1.5 h回流提取時(shí)，測(cè)得淫羊藿苷含量為0.896、0.986、0.980 mg/g。流動(dòng)相比例參照《中國(guó)藥典》2005版淫羊藿苷含量測(cè)定方法，作了微小調(diào)整。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，樣品中水溶性成分含量較高，造成基線不能回零，故對(duì)樣品進(jìn)行了純化處理，其中主要是對(duì)萃取溶劑的選擇。萃取溶劑的選擇，考察了乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、水飽和正丁醇等溶劑，其中采用三氯甲烷、乙醚時(shí)提取率非常低，采用乙酸乙酯的提取率僅為水飽和正丁醇的59%，故最終選擇水飽和正丁醇為萃取劑。

［1］梁其冰，黃守良.丹七滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（5）：837-840.

［2］中國(guó)藥典［S］.一部.2005：103.

［3］崔東煥，崔龍哲.康骨膠囊中紅花、三七的薄層色譜鑒別［J］.中國(guó)藥業(yè)，2008，17（10）：39.

［4］李玉賾，劉永先.養(yǎng)心丸中紅參、當(dāng)歸、丹參、五味子的薄層色譜鑒別［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6（3）：226.

［5］韓軍濤，夏華玲，何廣宏.羌?xì)w膝舒丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中醫(yī)正骨，2005，17（10）：77.

R927.2

B

1001-1528（2010）08-1446-03

2009-08-24

西華大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目（R0620512）

吳金偉（1984－），男，碩士研究生，研究方向：中藥制劑。

*通訊作者：何宇新（1976－），男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，博士，主要從事中藥新制劑新劑型研究。Tel：（028）87720552 0.021 6 μg～0.345 6 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r=0.999 9，平均回收率為99.82%，RSD值為0.70%。結(jié)論：本試驗(yàn)建立的方法可以用作冠脈通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。