對市售燈盞花素片的質(zhì)量考察

鄒 龍， 朱敬杰， 劉清飛， 林俊生， 羅國安*， 王義明

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心，北京100084；3.江西中醫(yī)學(xué)院中藥系，江西南昌 330006）

對市售燈盞花素片的質(zhì)量考察

鄒 龍1， 朱敬杰1， 劉清飛2， 林俊生3， 羅國安2*， 王義明2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心，北京100084；3.江西中醫(yī)學(xué)院中藥系，江西南昌 330006）

燈盞花素片；燈盞乙素；質(zhì)量考察；市售

目的：對不同廠家不同批次的燈盞花素片進(jìn)行質(zhì)量考察。方法：建立了HPLC測定燈盞花素片中燈盞乙素含量，測定崩解時(shí)限及硬度。其中，HPLC方法的條件為：Agilent TC-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸=23∶77（V/V）為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，檢測波長：335 nm，柱溫為35℃。結(jié)果：所測產(chǎn)品的燈盞乙素含量在（15.67±0.12）mg～（17.92±0.34）mg之間，崩解時(shí)限在1～26min范圍內(nèi)，硬度差異較大，在（7±2）N～（69±6）N之間。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中所建立的色譜方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。各廠家生產(chǎn)的燈盞花素片中燈盞乙素含量、崩解時(shí)限均符合衛(wèi)生部頒標(biāo)準(zhǔn)，但質(zhì)量存在差異。

燈盞花素是從菊科植物短葶飛蓬 （燈盞細(xì)辛）Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.全草中提取的黃酮苷類成分［1］。燈盞花素片即為該類有效成分制成的片劑，收載于部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十三冊中［2］。燈盞花素主要為燈盞乙素（野黃芩苷）和燈盞甲素的混合物，其中燈盞乙素（5，6，4′-三羥基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷）含量占95%以上［3］。現(xiàn)代藥理研究表明：燈盞花素能有效舒張腦血管，降低腦血管阻力，增加腦血流量；有抗凝血、抗血栓形成及促進(jìn)纖溶活性作用；此外對肝腎也有保護(hù)作用［4-6］。臨床上主要用于治療中風(fēng)后遺癥，冠心病，心絞痛等。目前，國內(nèi)有多個(gè)藥廠生產(chǎn)的燈盞花素片，質(zhì)量是否全部符合要求，是臨床安全有效應(yīng)用的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相法對國內(nèi)7個(gè)廠家共14個(gè)批號的燈盞花素片進(jìn)行含量測定，并結(jié)合崩解時(shí)限和硬度，考察國內(nèi)不同廠家燈盞花素片質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器

Agilent 1100（美國）高效液相色譜儀：G1311A型泵，G1315型DAD檢測器；RUC-5200型超聲波清洗機(jī)（上海睿祺電子設(shè)備有限公司）；梅特勒-托利多精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；YPD-200C型片劑硬度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；LB-LD型崩解時(shí)限測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

試劑：乙腈（色譜純，默克，德國），水為重蒸水，甲醇（分析純，上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）。磷酸（含量≥85%，廣州化學(xué)試劑廠）。試藥：燈盞乙素對照品（HPLC檢測純度為100%，中國藥品生物制品檢定所，批號：110842-200605）供含量測定用；燈盞花素片樣品均為市售成藥（A1湖南康普制藥有限公司，批號080111；A2湖南康普制藥有限公司，批號080501；B1昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號08AD；B2昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，批號09AF；C1昆明興中制藥責(zé)任有限公司，批號20080902；C2昆明興中制藥責(zé)任有限公司，批號20090102；C3昆明興中制藥責(zé)任有限公司，批號20090302；D1云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號20080502；D2云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號20090101；D3云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號20090401；E1云南省玉溪望子隆生物制藥有限公司，批號20080201；E2云南省玉溪望子隆生物制藥有限公司，批號20090201；F1廣東彼迪藥業(yè)有限公司，批號20081101；G1廣東環(huán)球制藥有限公司，批號081002）。

圖1 空白溶劑（A）、對照品（B）和供試品（C）HPLC色譜圖

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的燈盞乙素對照品10.16 mg，置50 mL量瓶中，加入適量的甲醇超聲溶解，冷至室溫后補(bǔ)充甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為203.2 μg/mL燈盞乙素對照品儲(chǔ)備液。精密量取燈盞乙素對照品儲(chǔ)備液1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得燈盞乙素對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取燈盞花素片10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于燈盞花素20 mg），置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min［2］，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。精密量取續(xù)濾液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾即得。

同法制備不含燈盞花素片的空白溶液。

2.3 HPLC色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸 =23∶77（V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：335 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 專屬性試驗(yàn)

分別吸取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液，按HPLC色譜條件檢測，色譜圖見圖1。在本色譜條件下，供試品中的燈盞乙素主峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5，對稱因子為0.99，按燈盞乙素峰計(jì)算理論塔板數(shù)為14 000，表明本分析方法專屬性好。

2.3.3 線性關(guān)系考察、最低檢測限和最低定量限

分別精密吸取2.1項(xiàng)下燈盞花乙素對照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10.16、20.32、30.48、40.64、60.96、81.28 μg/mL 的系列對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，吸取續(xù)濾液，按HPLC色譜條件測定其峰面積。以峰面積（A）對濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=21.130C－5.398 0，R2=0.999 9，表明燈盞乙素在 10.16～81.28 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。

取濃度為10.16 μg/mL燈盞乙素對照品溶液，稀釋至適當(dāng)濃度，按HPLC色譜條件測定。當(dāng)S/N≥3時(shí)，即為最低檢測濃度；當(dāng)S/N≥10時(shí)，即為最低定量濃度。本色譜條件下最低檢測限為0.010 16 μg/mL，最低定量限為 0.033 87 μg/mL。

2.3.4 精密度考察

取2.3.3 項(xiàng)下的低（10.16 μg/mL）、中（40.64 μg/mL）、高（81.28 μg/mL）3 種濃度的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d進(jìn)樣6次，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1。燈盞乙素低、中、高3種濃度的日內(nèi)、日間RSD<1%，表明該分析條件下精密度較好。

表1 日內(nèi)及日間精密度結(jié)果（n=6）

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.2項(xiàng)下供試品的制備方法，對同一批樣品（A1），制備6份供試品溶液，按HPLC色譜條件檢測。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算燈盞乙素含量（mg/片）及RSD。結(jié)果見表2。燈盞乙素的平均含量為（16.21±0.33）mg/片，RSD=2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性結(jié)果（n=6）

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.2項(xiàng)下方法操作制備供試溶液（A1），室溫放置，分別于 0、2、4、6、8 h，按 HPLC 色譜條件檢測含量（n=3），計(jì)算RSD，考察供試品中燈盞乙素的穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。8 h內(nèi)燈盞乙素含量RSD=0.65%，表明供試品溶液中燈盞乙素含量較為穩(wěn)定。

表3 供試品溶液中燈盞乙素穩(wěn)定性結(jié)果（n=3）

2.3.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品（A1）細(xì)粉適量，共9份，分置50 mL量瓶中，分別精密加入燈盞乙素對照品適量（約相當(dāng)于廠家標(biāo)示量燈盞乙素含量的80%，100%，120%）各3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品液，按HPLC色譜條件檢測，計(jì)算燈盞乙素的回收率。結(jié)果見表4。低、中、高3種燈盞乙素加入量的平均回收率均在99.69% ～101.26%之間，且RSD≤3%，表明回收率較好。

表4 回收率的試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4 樣品含量測定

取各廠家不同批號的燈盞花素片供試品按2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按HPLC色譜條件檢測，計(jì)算燈盞乙素含量（mg/片）。燈盞乙素含量在15～20 mg/片之間，各廠家的燈盞花素片中燈盞乙素含量與標(biāo)示量相比均偏低。具體結(jié)果見表5。

表5 各廠家燈盞花素片中燈盞乙素含量、崩解時(shí)限及硬度測定結(jié)果（n=3）

2.5 崩解時(shí)限的測定

照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅫA崩解時(shí)限檢查法檢查燈盞花素片的崩解時(shí)限。將吊籃通過上端的不銹鋼軸懸掛于金屬支架上，浸入1 000 mL燒杯中，并調(diào)節(jié)吊籃位置，使下降時(shí)篩網(wǎng)距燒杯底部25 mm，燒杯內(nèi)盛有溫度為（37±1）℃的水，調(diào)節(jié)水位高度使吊籃上升時(shí)篩網(wǎng)在水面下15 mm處。取供試品6片，分別置于上述吊籃的玻璃管內(nèi)，加擋板，開始進(jìn)行崩解時(shí)限檢查，記錄崩解時(shí)間。結(jié)果見表5，各廠家各批號的燈盞花素片崩解時(shí)限均小于30 min，符合衛(wèi)生部頒標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 硬度的測定

取各廠家不同批號的燈盞花素片供試品，利用片劑硬度儀檢測供試品的硬度。結(jié)果表明：各廠家各批號的燈盞花素片硬度差異較大，具體結(jié)果見表5。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

對燈盞乙素的含量進(jìn)行方差分析，各廠之間的具體方差分析見表6，各廠家各批號燈盞乙素占標(biāo)示量的百分含量的方差分析見表7。結(jié)果表明，不同廠家之間，以及不同批號間均存在著差異。

3 討論

3.1 關(guān)于燈盞花素片中燈盞乙素的含量測定方法時(shí)有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)建立的燈盞乙素檢測方法具有分析時(shí)間短、靈敏度高、重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可用于本制劑的質(zhì)量控制。

表6 各廠家燈盞花素片中燈盞乙素占標(biāo)示量百分含量方差分析

表7 各廠家各批號燈盞花素片中燈盞乙素占標(biāo)示量百分含量方差分析

3.2 本實(shí)驗(yàn)采用了衛(wèi)生部頒標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的燈盞乙素提取方法，即甲醇超聲提取法。含量測定之前曾比較了提取時(shí)間的影響，超聲15 min，20 min，30 min的提取結(jié)果基本相同，說明30 min的提取不會(huì)破壞燈盞乙素。為保證提取完全，超聲時(shí)間定為30 min，這與部頒標(biāo)準(zhǔn)一致。

3.3 市售燈盞花素片的崩解時(shí)限均符合藥典要求，但是各廠家產(chǎn)品的崩解時(shí)限和硬度差異較大，其中A1硬度偏小，取藥時(shí)即發(fā)生碎片現(xiàn)象。

3.4 根據(jù)衛(wèi)生部頒標(biāo)準(zhǔn)要求，燈盞花素片中燈盞乙素的含量應(yīng)為15～20 mg/片。實(shí)際測定的7個(gè)廠家共14個(gè)批號的燈盞花素片的含量均符合衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)的要求。但不同廠家生產(chǎn)的燈盞花素片中燈盞乙素與標(biāo)示量相比普遍偏低，且有些廠家之間含量差異顯著。這可能使得在臨床應(yīng)用該制劑時(shí)，產(chǎn)生藥效差異。燈盞花素片中燈盞乙素為發(fā)揮藥效的主要成分，為了進(jìn)一步提高燈盞花素片的療效和質(zhì)量，作者建議以燈盞乙素的含量確定投藥量，保證有效成分含量在一定范圍內(nèi)，防止含量波動(dòng)過大，造成臨床療效的不穩(wěn)定。

［1］張衛(wèi)東，陳萬生，王永紅，等.燈盞花黃酮苷化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2000，31（8）：565-566.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2516-97［S］.

［3］崔建梅，吳 松.燈盞花素的研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（3）：255-258.

［4］王麗娟，朱坤杰，邱麗萍，等.燈盞花素對動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］.中國藥業(yè)，2000，9（1）：26-27.

［5］王 影，楊樣良，劉 宏，等.燈盞花素抗凝血作用的研究［J］.中藥材，2003，26（9）：656-658.

［6］王 文，行 利，李軍昌，等.燈盞花素注射液對糖尿病腎病患者血液流變學(xué)的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24（5）：411.

R927.2

A

1001-1528（2010）07-1147-04

2009-11-04

鄒 龍（1969－），男，博士，副教授，主要從事中藥新制劑與新劑型研究。Tel：（0731）88458230 E-mail：zoulong100@yahoo.com.cn