湖南省規模化豬場豬源大腸桿菌耐藥性調查

于桂陽

（湖南永州職業技術學院農學系，湖南 永州 425000）

規模化、集約化養殖業的持續發展離不開抗菌藥物。然而，抗菌藥物在養殖業的廣泛使用也引起了動物源細菌耐藥性的日益加重與廣泛傳播。動物源細菌耐藥性的流行不僅加大畜禽疫病的防控難度，給養殖業造成巨大損失，而且動物源耐藥菌還可通過食物鏈感染人體或將耐藥基因轉移至人體致病菌，給食品安全和人體健康帶來潛在危害[1]。因此開展耐藥性監測與分析對獸藥殘留監控發揮著積極作用，本試驗重點監測豬源大腸桿菌對常用藥物的耐藥情況調查及分析。

1 材料與方法

1.1 病料

疑似大腸桿菌病的病料采集。病料采集時間為2010年7月，采集規模化豬場有腹瀉癥狀仔豬肛試標本，分離來自湖南省不同縣區的6個規模化養豬場共計65個病料標本的大腸桿菌致病菌株。

1.2 培養基與試紙

培養基：普通瓊脂培養基、普通肉湯培養基、麥康凱瓊脂培養基、伊紅美藍培養基、MH瓊脂培養基、LB培養基 （均購自北京奧博星生物技術有限公司）。

藥敏紙片：氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、安普霉素、環丙沙星、氨芐青霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素、四環素和氯霉素 （頭孢噻呋、氟苯尼考、安普霉素的藥敏紙片自制，其他藥品的藥敏紙片均購自杭州微生物試紙有限公司）。微量生化反應管 （杭州微生物試紙有限公司）。

1.3 試驗儀器與材料

試驗材料：接種環、平皿、三角瓶、新華濾紙、游標卡尺、試管、打孔器、注射器、消毒棉簽、移液器、移液管等。

試驗儀器：自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）、電子天平 （北京塞多利斯儀器系統有限公司）、SWCJ-1F型單人雙面凈化工作臺 （蘇州凈化設備有限公司）、GHP-9080隔水式恒溫培養箱 （上海齊欣科學儀器有限公司）、DHZ-D恒溫振蕩搖床 （太倉市實驗儀器設備廠）、LDZX-50FBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器 （上海申安醫療器械廠）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海精宏實驗設備有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 分離培養

用醫用棉簽采集有腹瀉癥狀豬只肛門內的糞樣，采集后將其裝入無菌的EP管或青霉素小瓶中[2]。用滅菌的生理鹽水將糞樣稀釋后，吸取0.5mL稀釋液加入到裝有5mL普通肉湯培養基的試管中，將試管置于恒溫振蕩搖床內37℃增菌培養12～16小時后，用接種環將培養物劃線于伊紅美藍瓊脂平板上，置于恒溫培養箱內37℃培養16小時后用鉑金耳挑取帶金屬光澤、中等大小、表面光滑圓潤的暗紅色單個菌落劃線于麥康凱瓊脂培養基，37℃培養16小時后挑取磚紅色、中等大小、表面光滑濕潤、圓形、扁平的菌落劃線于斜面培養基上進行保存。對保存在斜面培養基上的細菌先涂片，再用革蘭氏染液染色后，用100倍的光學顯微鏡進行鏡檢，根據細菌形態和染色特點，將革蘭氏染色為陰性、兩端鈍圓、無芽孢、中等大小的桿菌初步判定為大腸桿菌。

1.4.2 生化試驗

取分離培養物進行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖的發酵試驗，同時進行吲哚、M-R、VP和硫化氫試驗。糖發酵試驗在24小時觀察結果，其他生化試驗在48～72小時內觀察結果。

1.4.3 藥敏試驗

用鉑金耳在斜面上挑取少量大腸桿菌放入裝有10mL MH液體培養基的三角瓶中，將三角瓶置于搖床內37℃培養8～12小時，取出后與BaCl2標準比濁管進行對比并進行稀釋，使菌液的濃度與比濁管的濃度相當，此時菌液的濃度約為108CFU/mL。

將稀釋好的菌液 （108CFU/mL）倒入MH培養基平板內，倒入的菌液量以剛好覆蓋整個培養基表面為宜，讓培養基表面菌液均勻分布，倒掉多余的菌液。用滅過菌的鑷子夾取藥敏紙片，均勻地放置在平板培養基上，每個平板上放7片紙片。紙片放好后靜置10分鐘，然后將平板倒置放入恒溫培養箱內37℃培養18小時。將培養了18小時的培養基平板取出后置于背景為黑色的物體上，用游標卡尺精確測量抑菌圈的直徑，結果以毫米 （mm）計。判定標準采用美國臨床檢驗標準委員會（NCLLS）標準判定藥物的敏感性，見表1。

2 結果

2.1 細菌分離培養結果

大腸桿菌在普通瓊脂平板上長出灰白色露珠樣光滑、隆起、邊緣整齊的菌落。在麥康凱瓊脂平板上，形成中等大小的紅色菌落。在伊紅美藍瓊脂平板上，形成帶有金屬光澤的紫黑色小菌落。對65份樣品進行分離純化，分離到了58份大腸桿菌菌株，大腸桿菌分離率89.2%，大腸桿菌分離情況見表2。

2.2 顯微鏡檢查

在光學顯微鏡下對分離菌株進行油鏡觀察，桿菌呈短桿狀、成簇分布或散在，革蘭氏染色陰性，符合大腸桿菌的形態。

2.3 生化試驗結果

從表3可以看出，58株分離的菌株均可發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、不發酵蔗糖。M-R試驗、吲哚試驗為陽性，VP試驗陰性，不產生H2S，生化反應的符合率均在96%以上，其中葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖等四項生化反應符合率均達到100%，乳糖、M-R試驗和VP試驗等生化反應符合率98.3%，吲哚試驗和硫化氫試驗的生化反應符合率96.6%，符合大腸桿菌的生化特性。因此根據生化試驗的結果可鑒定分離菌株為大腸桿菌。結果見表3。

2.4 藥敏試驗結果

從表4可以看出，58株致病性大腸桿菌對13種受試抗菌藥物均有不同程度的耐藥性。對大腸桿菌耐藥率在70%以上的藥物有四環素、氨芐青霉素、恩諾沙星、阿莫西林、鏈霉素、諾氟沙星和環丙沙星等七種藥物，它們耐藥率分別為94.8%、91.4%、86.2%、81.0%、79.3%、74.1%和72.4%；耐藥率在30～70%之間的藥物有慶大霉素、氯霉素和頭孢噻呋鈉三種藥物，它們耐藥率分別為63.8%、63.8%和51.7%；耐藥率在30%以下的藥物有氟苯尼考、丁胺卡那霉素和安普霉素三種藥物，它們耐藥率分別為29.3%、25.9%和5.2%。

從圖1可以看出，抗菌藥物中敏感率最高的為安普霉素 （84.4%），其次為丁胺卡那霉素 （60.3%）。這可能與臨床上這兩種抗菌藥物的使用頻率較小有關。

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3 分析與討論

3.1 豬源大腸桿菌的耐藥情況分析

本試驗應用了13種抗菌藥物對湖南地區分離的58株豬源致病性大腸桿菌進行了藥物敏感性試驗，實驗結果顯示，豬源大腸桿菌分離菌株對目前常用和應用時間較長的抗菌藥物，如四環素、氨芐青霉素、恩諾沙星、阿莫西林、諾氟沙星等產生了非常嚴重的耐藥性。豬源大腸桿菌分離株對于一些新藥和未大量應用于豬場的藥物如安普霉素、丁胺卡那霉素等則比較敏感。因此細菌耐藥性與用藥情況密切相關。

3.2 豬源大腸桿菌耐藥特點

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產生耐藥性的細菌，試驗結果顯示，13種抗菌藥物對大腸桿菌均有不同程度的耐藥性，除安普霉素耐藥率只有5.2%外，其它12種抗菌藥物耐藥率均超過25%以上，尤其是氟喹諾酮類藥物作為一種較新的抗菌藥物，其耐藥率不斷增加。值得注意的是，通過比較相關研究數據，發現近年來豬源大腸桿菌的耐藥菌譜和耐藥率不斷增加。例如，2004年淮安地區分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率達30%。2007年分離的大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率已達到40%左右，其中恩諾沙星的耐藥率40.7%。本試驗分離大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為77.6%，其中恩諾沙星的耐藥率86.2%，呈現大幅度地上升，本試驗其它類抗菌藥物的耐藥性也出現類似現象[3]。耐藥產生的原因主要是臨床濫用藥，沒有注意用藥的交替性以及飼料添加藥物，從而導致細菌對抗菌藥物表現不同程度的耐藥性[4]。同時大腸桿菌一旦獲得耐藥性后，對大多數藥物的耐藥能力可超過常用治療量的數倍至數十倍，形成被膜后耐藥能力可超過常用治療量的數千倍。

目前，大腸桿菌的耐藥性已非常普遍，臨床上分離的致病性大腸桿菌幾乎都有耐藥性，而且不止耐受一種藥物，因此，我們選擇藥物時不能僅靠經驗，而要根據藥敏試驗選擇敏感藥物，或使用經過科學研究的復合制劑進行治療，才能達到有效治療，減少耐藥菌出現的目的。

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3.3 耐藥性與獸藥殘留

圖1 敏感率高的前5種抗菌藥物

長期使用抗菌素和濫用抗菌素是藥物殘留及細菌耐藥性產生的源頭。對人類健康構成最大威脅來源于長期使用抗菌素或濫用抗菌素引發的耐藥性細菌生長和抗藥基因的轉移[5]。長期使用抗菌素或濫用抗菌素和耐藥性是一對孿生兄弟，耐藥性不但主要源于治療人類疾病時大量使用抗菌素，還包括動物生產過程中長期使用抗菌素，使耐藥性的危害越來越嚴重，安全性隱患日趨突出[6]。本調查以大腸桿菌為指示菌研究了規模化豬場的細菌耐藥情況，大腸桿菌作為耐藥性的指示菌能夠從一個側面反應細菌的耐藥性。試驗結果顯示，豬源致病性大腸桿菌耐藥率增強，耐藥普擴大。隨著抗菌藥大量、廣泛的使用，加快了細菌耐藥性的發展，很多細菌對藥物由敏感逐漸變為耐藥，或由低水平耐藥轉為高水平耐藥，由單一耐藥發展到多重耐藥［7］。由于飼料中添加抗菌藥物，一方面增加了動物性食品中的獸藥殘留，促進人源性細菌耐藥性增加的可能，從而導致人類發生感染后使用抗生素無效或藥效下降，對人體健康構成威脅；另一方面也導致動物源性細菌耐藥性的增加，由于耐藥菌株不斷出現而導致抗生素治療無效給畜牧業帶來嚴重的經濟損失，同時病原微生物的耐藥性增強，醫療效果不佳，在此情況下，在養豬生產中使用抗菌藥物控制各種感染性疾病，劑量、范圍、種類的不規范使用，導致耐藥菌株的產生和細菌耐藥率的增加，隨著耐藥菌株的日益增多，抗菌藥物對細菌性疫病的防治效果越來越差，藥物用量也越來越大，如此形成惡性循環，豬病越來越多，藥越用越多，獸藥殘留問題也越來越嚴重，從而影響畜禽產品質量，威脅人類健康。因此，豬場在應用抗菌藥物進行臨床治療時，不應僅憑經驗用藥，有條件的豬場最好根據藥物敏感性試驗的結果選擇敏感性高的藥物，并充分考慮這些藥物本身特性和藥物之間的復雜關系，采取聯合或交替用藥，并做到用藥適量，提高藥物防治疾病的效果。

[1]邱春媚，何家康，畢玉海.豬源大腸桿菌的耐藥性調查與對策.豬業科學，2008（08）：38-40

[2]樊國燕，臧金燦，邊傳周．規模化豬場大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監測.河南農業科學，2008（3）：110-112

[3]趙坤，王三虎，張婷，趙恒章，等．豫北地區豬源致病性大腸桿菌的耐藥性研究.河南科技學院學報：自然科學版．2008，36（1）：59-61

[4]田國寶，王紅寧，黃勇，柳蘋，等．規模化豬場大腸桿菌耐藥性和血清型變化趨勢例. 中國獸醫雜志，2007，43（10）：31-33

[5]張廣群，王春光，張國磊，呂建存，等．55株豬源大腸桿菌的耐藥性監測.中國動物檢疫，2006，23（2）：34-35

[6]楊柳，王思蘆，羅音久，曾中良，等．對規模化豬場大腸桿菌耐藥性的調查.四川畜牧獸醫，2006（5）：26-27

[7]陳宇，方雪燕，吳曉鳴．某規模化豬場大腸桿菌的耐藥性情況分析.福建畜牧獸醫，2006，28（5）：9-10．