石斛多糖提取工藝的研究

陳 蕤

（廣州科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥營(yíng)銷(xiāo)系，廣東廣州 510550）

石斛屬植物具有很高的藥用價(jià)值。而多糖類(lèi)成分是石斛中具有免疫增強(qiáng)作用[1]和抗腫瘤作用[2]的活性成分，常以多糖的含量高低來(lái)判斷石斛藥材質(zhì)量的高低。本研究對(duì)石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化探討，為其工業(yè)化生產(chǎn)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器設(shè)備有ESJ120-4型萬(wàn)分之一天平，電熱恒溫水浴鍋，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，755B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 試藥

石斛（四川樂(lè)山市歇馬鄉(xiāng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為細(xì)莖石斛）洗凈殺青后于60℃烘干，粉碎，過(guò)50目篩備用。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝[3-5]

取石斛粗粉約 50 g，加入石油醚（60～90℃）250 ml，回流提取1 h，脫脂，過(guò)濾，揮干溶劑，加入80%乙醇250 ml，回流提取1 h，過(guò)濾，揮干溶劑，加入蒸餾水浸提2次，趁熱過(guò)濾，減壓濃縮至150 ml，0.1%活性炭脫色，過(guò)濾，脫蛋白，加入95%乙醇使溶液含醇為80%，于冰箱中靜置過(guò)夜，沉淀物用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，烘干，得石斛多糖粗制品。

2.2 加水量的選擇

原料與水體積比分別為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，比較其多糖得率。

2.3 浸提溫度的選擇

分別在 80、85、90、100℃條件下浸提 3～4 h，比較其多糖得率。

2.4 蛋白去除方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Sevag法、TCA法[5-6]去除石斛多糖中的蛋白質(zhì)。

2.4.1 Sevag法 多糖提取液，真空抽濾，濃縮至一定體積，按比例加入氯仿-正丁醇混合液，劇烈振蕩，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液。如此反復(fù)操作3次。為取得最佳的實(shí)驗(yàn)效果，對(duì)提取條件設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)[7]，因素水平見(jiàn)表1。

表1 Sevag法脫蛋白正交設(shè)計(jì)Tab.1 Factors and their levels of the Sevag method

2.4.2 TCA法 多糖提取液，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液，加入草酸調(diào)整pH至pH=7，加入適量3%的TCA，沉淀蛋白質(zhì)，調(diào)整pH至pH=7，放置過(guò)夜，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液。如此反復(fù)操作3次，取平均值。

2.5 粗多糖含量的測(cè)定方法

運(yùn)用苯酚硫酸比色法[8]進(jìn)行粗多糖含量測(cè)定。

2.6 結(jié)果

2.6.1 不同加水體積對(duì)石斛多糖得率的影響 見(jiàn)圖1。

2.6.2 不同浸提溫度對(duì)石斛多糖得率的影響 見(jiàn)圖2。

2.6.3 Sevag法脫蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果 石斛多糖提取過(guò)程中應(yīng)用Sevag法脫蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，Sevag法與TCA法比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal test

表3 Sevag法與TCA法提取結(jié)果比較Tab.3 Comparison between Sevag method and TCA method

3 討論

3.1 石斛多糖提取前除雜質(zhì)

石斛多糖提取前，先用石油醚或乙醚回流提取，可以除去石斛植物中的脂溶性雜質(zhì)及干擾性色素，而后用80%乙醇回流，除去蛋白質(zhì)及氨基酸等。

3.2 石斛多糖浸提時(shí)加水量的選擇

由圖1可知，加水量影響石斛多糖得率，隨著加水比的增加，石斛多糖的提取率呈上升趨勢(shì)。若加水比例過(guò)少，在沒(méi)有達(dá)到最佳浸提時(shí)間之前，浸出液已經(jīng)變得很少甚至糊鍋，從而影響多糖得率[5]。如果加水過(guò)多的話(huà)，則以后的濃縮過(guò)程較繁雜，所以選擇原料與水的比例為1∶50。

3.3 石斛多糖浸提溫度的確定

由圖2可知，在90℃條件下浸提3～4 h，可達(dá)到較多的多糖得率。浸提時(shí)，溫度過(guò)低則導(dǎo)致溶劑的滲透能力和溶劑能力降低，使多糖不能有效溶出，溫度過(guò)高則使得多糖被破壞，使多糖得率降低[4]。

3.4 活性炭脫色

多糖成分中會(huì)存在一些殘留色素，因此需要用活性炭脫色[9]，加入后應(yīng)多保留幾分鐘，使其脫色完全。

3.5 多糖提取過(guò)程中脫蛋白方法的選擇

可得知 A2B2C3為最佳組合，即 V樣品∶V氯仿-正丁醇=1∶1、V氯仿：V正丁醇=10∶2.5、提取時(shí)間為 30 min時(shí)效果最佳，多糖得率為22.47%。

Sevag法脫蛋白的效果好于TCA法，粗多糖得率及多糖含量均較高，所需時(shí)間較短，但Sevag法也存在著重復(fù)多次、產(chǎn)生較多有機(jī)物質(zhì)等弊端；而TCA步驟較簡(jiǎn)單，所用試劑較少，色素物質(zhì)能在TCA液中隨蛋白質(zhì)沉淀而部分除去，有利于層析精制，但所需時(shí)間較長(zhǎng)[10]。因此，筆者認(rèn)為采用Sevag法除去石斛多糖中的蛋白質(zhì)更為合適。

3.6 多糖沉淀的分離、洗滌、干燥

經(jīng)乙醇沉淀后的多糖可通濾紙過(guò)濾、抽濾或者離心沉淀等分離得到，濾紙表面粗糙，過(guò)濾速度慢，消耗時(shí)間多，粘在上面的多糖不易洗脫，多糖獲得率會(huì)因此降低，因此在分離時(shí)選用離心沉淀。粗制品烘干前用無(wú)水乙醇、乙醚涮洗，可除去多余水分。丙酮需加長(zhǎng)洗滌時(shí)間、加大用量，盡量除去石斛多糖中的色素。粗多糖的干燥可采用自然干燥、高溫烘干等。為實(shí)驗(yàn)室操作方便，本實(shí)驗(yàn)采用70～80℃烘干至恒重的方法。

本實(shí)驗(yàn)確定石斛多糖最佳提取工藝條件為90℃水浸提3～4 h，料水體積比為 1∶50，采用 Sevag法脫蛋白，樣品：氯仿-正丁醇=1∶1（V∶V）、氯仿∶正丁醇=10∶2.5（V∶V）、提取時(shí)間為30 min，粗多糖得率為1.47%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.47%，需要進(jìn)一步純化精制。本結(jié)果促進(jìn)了石斛藥材的規(guī)?；N植，為藥材的工業(yè)化生產(chǎn)和利用提供理論基礎(chǔ)。

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