單硝酸異山梨酯注射液細菌內毒素檢查法研究

吳 婷，李 薇

（廣州市藥品檢驗所，廣東廣州 510160）

單硝酸異山梨酯注射液 （Isosorbide Mononitrate Injection）為新一代的長效硝酸酯類抗心絞痛藥物，通過擴張外周血管，特別是靜脈容量血管，減少回心血量，降低心臟前后負荷，使心肌耗氧量減少，發揮抗心肌缺血作用[1-2]。主要用于冠心病的長期治療，心絞痛的預防，心肌梗死后持續心絞痛的治療；與洋地黃或利尿劑聯合應用，治療慢性充血性心力衰竭。單硝酸異山梨酯注射液具有較強的擴張冠狀動脈作用，從而改善缺血性心臟病供血狀況，它還具有抑制血小板聚集和降低血液黏附作用[3]。本品與其他血管擴張劑、鈣拮抗劑、β受體阻滯劑、抗高血壓壓藥、三環抗抑郁藥及酒精合用，可強化本類藥物的降血壓效應。本品收載于國家藥品標準WS1-（X-078）-2004Z，但未規定細菌內毒素檢查標準。為了提高藥品控制標準，現對單硝酸異山梨酯注射液進行了實驗研究，建立了本品的細菌內毒素檢查質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

旋渦振蕩器（德國IKA，型號：MS-1）；四孔水浴鍋（英國GRANT，型號：SUB14）。

1.2 試藥

單硝酸異山梨酯注射液（a.批號：0601428，規格：5 ml∶20 mg，濟南利民制藥有限責任公司；b.批號：20050702，規格：5 ml∶20mg，山東海山藥業有限公司；c.批號：060110，規格：2 ml∶25 mg，南寧楓葉藥業有限公司；d.批號：040801，規格：2 ml∶25 mg，上海旭東海普藥業有限公司；e.批號：070502，規格：5 ml∶20 mg，廣東省博羅先鋒藥業集團有限公司）。鱟試劑（a.TAL，批號：0809091，規格：0.1 ml/支，標示靈敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司鱟試劑；b.TAL，批號：081124，規格：0.1 ml/支，標示靈敏度：0.25 EU/ml，廈門市鱟試劑實驗廠有限公司鱟試劑）。細菌內毒素工作標準品（CSE，批號：150601-200860，效價：160 EU/支，中國藥品生物制品檢定所）。內毒素檢查用水（BET 水，批號：0801180，規格：50 ml，湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定[4]

按《中國藥典》2005年版二部中細菌內毒素檢查法的規定，根據公式L=K/M，式中L為供試品的細菌內毒素限值，K為按規定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K=5 EU/（kg·h），M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按60 kg計算，注射時間若不足1 h，按1 h計算。

本品收載于國家藥品標準WS1-（X-078）-2004Z，規格：5 ml∶20 mg、2 ml∶25 mg、2 ml∶20 mg、1 ml∶10 mg， 熱原劑量為1 mg/kg。根據單硝酸異山梨酯注射液說明書的用法用量，靜脈滴注一般有效劑量：每小時 2～7 mg，一般速度：60～120 μg/min，本品的 M=7 mg/（60 kg·1 h）=0.12 mg/（kg·h）。 K 為 5 EU/（kg·h），本品用于心血管藥、兒童老人用藥，根據《注射劑安全性檢查法應用指導原則》（修訂稿）的要求安全系數定為3，按公式L=K/M計算，則L=14 EU/mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復核試驗

按照《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪE“鱟試劑靈敏度復核試驗”項下進行，結果見表1。2批鱟試劑靈敏度分別為0.18、0.25 EU/ml，均在 0.50～2.00 范圍內，靈敏度符合規定，可用于細菌內毒素檢查。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗Tab.1 Sensitivity test of tachypleus amebocyte lysate

單硝酸異山梨酯注射液有效稀釋濃度（MVC）的計算[5-6]根據公式MVC=λ/L，其中L為內毒素限值14 EU/mg，λ為鱟試劑標示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度范圍為0.50～0.03 EU/ml，則單硝酸異山梨酯注射液對應的有效稀釋濃度分別為0.040 0、0.020 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/ml。

2.3 干擾預試驗[7]

用細菌內毒素檢查用水將單硝酸異山梨酯注射液分別稀釋至 0.040 0、0.020 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/ml的濃度，將此系列稀釋液記為NPC系列，同時在上述系列的試驗液中加入2λ濃度的細菌內毒素標準溶液，記為PPC系列。取靈敏度為0.25 EU/ml的兩個廠家的鱟試劑，分別與上述NPC、PPC系列進行反應，每一濃度重復兩管，并設陽性和陰性對照。結果見表2、3。

表2 單硝酸異山梨酯注射液的干擾預試驗1Tab.2 Results of prerliminary interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 1

表3 單硝酸異山梨酯注射液的干擾預試驗2Tab.3 Results of prerliminary interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 2

由以上干擾預試驗結果可以初步了解，兩個廠家鱟試劑對單硝酸異山梨酯注射液的細菌內毒素的試驗結果均在0.04 mg/ml以下濃度時無干擾。

2.4 干擾試驗

為了最終確認無干擾因素，進行以下干擾試驗。將單硝酸異山梨酯注射液用細菌內毒素檢查用水進行稀釋，使其最終濃度為0.02 mg/ml，按照《中國藥典》2005年版二部附錄中的“細菌內毒素檢查供試頻干擾試驗”項下進行試驗，結果見表 4、5。

表4 單硝酸異山梨酯注射液的干擾試驗1Tab.4 Results of interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 1

表5 單硝酸異山梨酯注射液的干擾試驗2Tab.5 Results of interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 2

5批單硝酸異山梨酯注射液用兩個廠家生產的鱟試劑進行試驗，結果單硝酸異山梨酯注射液0.02 mg/ml稀釋溶液對兩個廠家生產的鱟試劑無干擾作用，Es/Et均在0.5～2.0范圍內。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取9個廠家生產的22批單硝酸異山梨酯注射液，分別稀釋到0.02 mg/ml，使用兩個廠家的靈敏度均為0.25 EU/ml的鱟試劑，按照《中國藥典》2005年版二部附錄“細菌內毒素檢查法”進行檢查，結果全部符合規定。由此可得結論，單硝酸異山梨酯注射液稀釋到0.02 mg/ml時對鱟試劑與內毒素凝集反應無干擾作用，可適用細菌內毒素檢查法。

3 討論

本品單硝酸異山梨酯注射液收載于國家藥品標準WS1-（X-078）-2004Z，規格：5 ml∶20 mg、2 ml∶25 mg、2 ml∶20 mg、1 ml∶10 mg。現有的標準規定為熱原檢查，劑量為1 mg/kg。目前本品無細菌內毒素檢查項標準，如采用鱟試劑法來控制細菌內毒素，操作簡易且結果可靠。從干擾預試驗和正式干擾試驗可知，單硝酸異山梨酯注射液對鱟試劑無干擾的有效濃度范圍在0.04 mg/ml以下，在此濃度范圍內，可用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑進行檢驗。由于不同廠家生產的鱟試劑其抗干擾能力存在差異，所以本實驗采用了兩個廠家鱟試劑進行干擾試驗。實驗結果表明，單硝酸異山梨酯注射液稀釋到0.02 mg/ml時對鱟試劑與內毒素凝集反應無干擾作用，可適用細菌內毒素檢查法。因此，本品采用限值14 EU/mg進行細菌內毒素檢查法代替熱原檢查法是可行的。

[1]王茹.靜脈滴注單硝酸異山梨酯注射液治療冠心病心絞痛的臨床觀察與護理[J].臨床醫藥實踐雜志,2008,39(2):140.

[2]方巧云,江曉風.靜滴魯南欣康治療高血壓急癥的臨床觀察與護理[J].臨床護理雜志,2005,6(4):65-66.

[3]宋文宣,張七一,孫王安,等.實用心血管病藥學[M].北京:人民衛生出版社,2001:553-554.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005:Ⅺ E.

[5]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社,2005:287-297.

[6]潘正興,宋勤.注射用奧美拉唑鈉細菌內毒素檢查法[J].藥物分析雜志,2008,28(2):275-277.

[7]王慧明,陳邦樹.胞磷膽堿鈉注射液細菌內毒素檢查法[J].中國藥師,2005,8(9):793.