布地奈德對流感病毒感染后小鼠嗅上皮嗅覺標記蛋白表達的影響

萬桂蓮,倪道鳳,關 靜

(中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院耳鼻咽喉科,北京100730)

上呼吸道病毒性感染是引起嗅覺障礙的常見疾病,發病率約為20-30%[1]。引起呼吸道病毒性感染的常見病原有流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒、腸道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和麻疹病毒,其中流感病毒對嗅覺的影響已為許多學者廣泛研究[2,3]。臨床上常應用糖皮質激素來治療上呼吸道病毒性感染引起的嗅覺障礙。糖皮質激素治療嗅覺障礙的報道較多,而對布地奈德的觀察少見報道。本研究以嗅覺標記蛋白(olfactory marker protein,OMP)為研究指標,選用甲型流感病毒(HINI),模擬上呼吸道病毒感染動物模型,觀察布地奈德對流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP的作用,以期為臨床應用激素治療嗅覺障礙提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗動物選用無致病原近交系BALB/c小鼠,雄性,六周齡,體重20±1 g,由中國醫學科學院實驗動物研究所提供,動物在同一條件下由中國醫學科學院實驗動物研究所飼養。

1.1.2 流感病毒 流感病毒鼠適應株A/PR8/34(H1N1)病毒液,由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供。分裝后凍存于-80℃冰箱備用。

1.1.3 主要的試劑 山羊抗鼠嗅標記蛋白抗體,購自Wako有限公司;辣根酶標記兔抗山羊抗體,非生物素二步法免疫組化檢測試劑(Two-Step IHC Detection Reagent,PV-6003),購自北京中杉金橋生物技術有限公司;專用硝酸纖維(nitrocellulose,NC)膜,購自Amersham Biosciences公司;ECL增強化學發光試劑盒,購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 將50只BALB/c小鼠隨機分為5組(每組10只小鼠):非感染對照組(正常對照組)、流感病毒感染對照1組(病毒對照1組),流感病毒感染對照2組(病毒對照2組),布地奈德1組,布地奈德2組,分別與病毒對照1組和病毒對照2組對照。

1.2.2 病毒接種 本實驗根據Reed-Muench法測定流感病毒鼠適應株A/PR8/34(H1N1)病毒對小鼠的半數致死量(LD50)為10-3.5,根據LD50結果將流感病毒液按10-4稀釋,小鼠乙醚吸入麻醉,用可調微量移液器取50 μ l病毒液,緩慢適量滴進小鼠的前鼻孔,每側25 μ l,使病毒液隨呼吸氣流緩慢進入鼻腔,待麻醉恢復后,將小鼠按組分籠隔離飼養。

1.2.3 給藥 經鼻吸入布地奈德組按3 mg/kg給藥[4,5],布地奈德1組小鼠在病毒感染1天后開始給藥,布地奈德2組小鼠在病毒感染3天后開始給藥,病毒1組和病毒2組分別在相同時間點均經鼻吸入等量的生理鹽水。

1.2.4 免疫組織化學染色 染色方法采用SP法。分別在第7天和第10天從每組小鼠取3只,麻醉灌注后取鼻腔標本常規固定和切片。采用PH8.0Tris-EDTA修復液,微波熱修復,92-98℃,10 min,于室溫中冷卻,放入3%H2O2溶液室溫10 min,滴加1抗OMP蛋白抗體(1∶4 000),37℃恒溫箱孵育 1.5 h。滴加非生物素2抗(1∶5 000),37℃恒溫箱孵育30分鐘,二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒顯色,染色時間為25秒,蘇木素復染,水洗,鹽酸酒精分化,常規脫水、透明、封片,光學顯微鏡觀察雙側鼻腔嗅區粘膜。陰性對照實驗采用正常山羊血清代替一抗,其余步驟同上。在顯微鏡下計數每只小鼠鼻腔切片嗅區粘膜內5個高倍視野(x400)下OMP陽性細胞數,取其平均值為該例的測量值。

1.2.5 嗅粘膜組織全蛋白提取 在第7天和第10天分別從每組取出7只小鼠,頸椎脫臼法處死小鼠,矢狀位正中裂開鼻腔,解剖顯微鏡下取鼻中隔嗅區黏膜,經不銹鋼篩網研磨過濾,留取細胞混懸液,放入離心機離心2次(4 000 r/min,5 min-1),棄上清液,加入適量的細胞裂解液(Tris HCl 2 ml,NaCL 6 ml,EDTA 0.2 ml,EGTA 0.2 ml,Tritonx-100 1 ml,焦磷酸鈉 0.066 5 g,β-甘油磷酸鈉 0.1 ml,原礬酸鈉 10 ml,蒸餾水 85 ml),冰上裂解10分鐘,超聲細胞粉碎機裂解細胞8次(200 W,5 s-1,間隔5 s),再放于低溫超速離心機中離心(4℃,12 000 r/min,25 min),取上清液,Bardford法檢測上清液蛋白濃度。

1.2.6 western blot 根據OMP蛋白分子質量大小(20 KD),制作15%的分離膠和5%的濃縮膠,取標本細胞裂解蛋白20 μ g,進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓為80 V,分離膠電壓為120 V,凝膠-NC膜轉移裝置浸于轉膜緩沖液,恒壓80 V轉移2 h,轉到NC膜上,用5%的脫脂牛奶封閉2 h,然后加入1抗山羊抗鼠嗅標記蛋白抗體(1∶2 000)封閉,放于搖床上室溫2 h,洗膜后加入2抗辣根酶標記兔抗山羊抗體(1∶4 000)孵育1 h,洗膜后加ECL顯像劑,將NC膜放入壓片暗盒,膠片曝光顯影。所獲結果經灰度定量掃描,以β-actin條帶為內參照,校正對應的OMP條帶,測定各顯色條帶的吸光度值,半定量表示其表達水平。

1.3 統計學分析

所有資料采用SPSS11.0統計分析軟件進行處理,所得到的數值均以±s表示,各組數據的比較應用配對t檢驗和獨立樣本t檢驗分析。

2 結果

2.1 OMP在嗅粘膜的表達定位和陽性率比較 光鏡下OMP陽性主要定位于小鼠嗅粘膜的上皮層,呈棕褐色或淺棕色染色。正常對照組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細胞呈棕褐色,大量分布于嗅上皮層(圖1A)。病毒對照組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細胞數量明顯減少(圖1B,D),而與病毒對照組相比,布地奈德組小鼠嗅上皮OMP染色陽性細胞明顯增加(圖1C,E)。經圖像分析結果顯示,布地奈德1組和布地奈德2組嗅上皮OMP陽性細胞數明顯高于病毒對照1組和病毒對照2組,差異有統計學意義(P＜0.01);病毒對照1組和病毒對照2組OMP陽性細胞數分別低于正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.01);布地奈德1組、布地奈德2組與正常對照組三組間分別比較,均沒有顯著性差異;病毒對照1組和病毒對照2組比較沒有顯著性差異(表1)。在陰性對照組的嗅上皮沒有觀察到OMP染色陽性細胞(圖1F)。

圖1 各組小鼠嗅上皮OMP表達的變化(×400)

表1 各組小鼠嗅上皮OMP陽性細胞的變化(±s,n=3)

表1 各組小鼠嗅上皮OMP陽性細胞的變化(±s,n=3)

P＜0.01,與病毒對照組比較

組別 OMP陽性細胞數正常對照組 72.44±1.31*病毒對照1組 56.12±2.10布地奈德1組 71.34±1.89*病毒對照2組 60.51±1.62布地奈德2組 70.98±1.43*

2.2 對流感病毒感染的嗅上皮布地奈德干預后OMP蛋白表達水平的變化 布地奈德1組OMP蛋白表達水平較病毒對照1組顯著增高(P＜0.01),與正常對照組和布地奈德2組沒有顯著性差異。布地奈德2組OMP蛋白表達水平比病毒對照2組顯著增高(P＜0.01),與正常對照組和布地奈德1組沒有顯著性差異。病毒對照1組和病毒對照2組OMP蛋白表達水平均比正常對照組明顯降低(P＜0.01),而病毒對照1組和病毒對照2組兩組間沒有顯著性差異(圖2)。

圖2 布地奈德對嗅上皮OMP蛋白表達的影響(±s,n=3)

3 討論

0MP是由成熟的嗅感覺神經元表達的一種蛋白質,在嗅上皮主要存在于嗅感覺神經元的胞體內。本實驗研究選擇的檢測指標OMP是由Margolis在1972年首先發現的[6]。Nathan等研究發現大鼠OMP的結構是一種單球形結構域蛋白,有2個長的α-螺旋和8條β折疊片斷。8條β鏈互相折疊形成β-殼狀結構組成OMP的中心。在殼狀結構的另一面形成兩個互相垂直的長螺旋結構,此外還有3個大的延伸的環狀區域,包括環1、環2和環3。環3與EphB2受體具有同源性,這可能對于調節蛋白之間的相互作用具有重要意義[7]。目前已知OMP在嗅覺系統發育、嗅覺信號轉導、嗅神經生理和神經發生等方面有重要作用[8]。

流感病毒感染和病毒復制過程可刺激機體產生和釋放促炎細胞因子如 TNF-α、IL-6等[9],引起以CD4+T淋巴細胞為主的免疫反應[10],引起鼻粘膜充血水腫,妨礙氣味分子與嗅粘膜表面接觸,影響嗅覺。有研究表明流感病毒感染可直接損傷嗅感覺神經元,誘導其凋亡引起嗅覺障礙[3,11]。臨床上應用布地奈德治療嗅覺障礙主要是利用布地奈德的抗炎和免疫調節作用,減弱鼻粘膜的充血和腫脹,改善鼻道通氣狀態,以期改善嗅覺。布地奈德改善嗅覺障礙除了上述機制外,是否對嗅感覺神經元有直接作用也引起一些學者的關注。為了探討布地奈德對病理狀態下嗅感覺神經元的作用,本實驗以OMP為研究指標,選用A/PR8/34甲型流感病毒感染小鼠,模擬上呼吸道病毒感染動物模型,觀察布地奈德對流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP表達的影響,以期為臨床應用布地奈德治療嗅覺障礙提供一定的實驗依據。

本實驗采用免疫組化和western blot方法檢測嗅上皮OMP表達水平,發現布地奈德組小鼠嗅上皮OMP的蛋白表達水平明顯上調,提示布地奈德能促進小鼠嗅上皮OSNs的OMP表達。布地奈德通過與胞漿內糖皮質激素受體(glucocorti-coid receptor,GR)結合誘導受體構象發生變化,使其與核內靶基因的激素反應元件結合,激活或抑制靶基因的表達。2008年Puiols等用活檢鼻息肉病理標本應用免疫組化和RT-PCR技術證實鼻用布地奈德能夠上調鼻粘膜中GRα mRNA表達,GRβ表達沒有顯著性變化[12]。這個理論支持布地奈德參與了嗅上皮OMP蛋白表達的調節。本研究中病毒對照組小鼠嗅上皮OMP的表達量明顯下降,提示流感病毒能損害OSNs而抑制OMP表達,本實驗結果支持陳志宏等的觀點[11]。

本研究發現布地奈德使流感病毒感染小鼠嗅感覺神經元的OMP蛋白表達增加,由此我們推測布地奈德與嗅感覺神經元胞漿內的GR結合,糖皮質激素-受體復合物進入細胞核,作用于糖皮質激素反應元件的特異性DNA序列,啟動OMP基因表達,經過轉錄翻譯合成蛋白質,影響嗅覺信號的轉導,為布地奈德改善嗅覺障礙提供一定的實驗依據,但本實驗僅是模擬上呼吸道病毒感染動物模型,仍有一定的局限性,需要建立各種嗅覺障礙動物模型繼續觀察布地奈德的作用,以期為臨床嗅覺障礙的治療提供可靠的指導依據。

致謝:在本實驗過程中得到中國醫學科學院中國協和醫科大學基礎醫學研究所生物化學與分子生物學國家重點實驗室許彩民教授指導和楊洋老師與實驗病理中心陳錫萍老師幫助,特此感謝。

[1]Jafek B.W,Murrow B,LinschotenM.Evaluation and treatment of anosmia[J].Current Opinion Otolaryngo&Head&Neck Surgery,2000,8:63.

[2]Mackie PL.The classification of viruses infecting the respiratory tract[J].Paediatr Respir Rev,2003,4(2):84.

[3]Welqe-Lüssen A,WolfensberqerM.Olfactory disorder following upper respiratory tract infections[J].Adv Otorhinolarynqol,2006,63:125.

[4]Corteling R,Trifilieff A.Gender comparison in a murine model of allergen-driven airway inflammation and the response to budesonide treatment[J].BMC Phar macol,2004,4:4.

[5]Wyss D,Bonneau O,Trifilieff A.Mast cell involvement in the adenosine mediated airway hyper-reactivity in a murine model of ovalbumin-induced lung inflammation[J].BJ Phar macol,2005,145,845.

[6]MargolisFL.A brain proteinunique to the olfactory bulb[J].Proc Natl A-cad Sci USA,1972,69:1221.

[7]Nathan T,Wright,Joyce W,et al.Refinement of the solution structure of rat Olfactory Marker Protein(OMP)[J].Journal of Biomolecular NMR,2005,33:63.

[8]Reisert J,Yau KW,Margolis FL.Olfactory markerproteinmodulates of the odour-induced respons in cilia of mouse olfactory receptor neurons[J].J Physiol.2007,585(3):731.

[9]Julkunen I,Sareneva T,Pirhonen J,et al.Molecular pathogenesis of influenza A virus infection and virus-induced regulation of cytokine gene expression[J].Cytokine Growth Factor Rev,2001,12:171.

[10]黃文林.分子病毒學[M].北京:人民衛生出版社.

[11]陳志宏,倪道鳳,高 揚,等.凋亡相關基因 Bcl-2和bax及iNOS在流感病毒感染后小鼠嗅上皮的表達[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,27(11):510.

[12]Puiols L,Alobid I,Ben í tez P,et al.Regulation of glucocorticoid receptor in nasal polyps by systemic and intranasal glucocorticoids[J].Allergy.2008,63:1377.