大鼠坐骨神經切斷后相應脊髓節段Bcl-2、Bax蛋白表達及神經細胞凋亡

趙東波,孫鴻斌,李春雨,崔樹森

(吉林大學中日聯誼醫院手外科,吉林長春130033)

周圍神經損傷實質上是神經細胞軸突的損傷,必然影響相應神經細胞的存活和功能狀況,從而影響神經軸突的再生和功能恢復。因此,研究周圍神經再生和功能恢復的重點,應從神經胞體的功能狀況、軸突再生的影響因素和效應器的恢復潛能等方面綜合研究[1]。關于周圍神經損傷后,相應脊髓節段運動神經元胞體內Bcl-2、Bax蛋白的表達是否明顯活化以發揮其調節作用,以及損傷后不同時相表達水平的變化報道較少。本研究采用大鼠坐骨神經切斷的動物模型,通過TUNEL法和免疫組化染色法檢測相應節段神經細胞的凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表達。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

健康雄性Wistar大鼠35只,體重250-300 g(吉林大學動物實驗室),隨機分為假手術組(5只)和損傷組(30只)。實驗組再分為六個小組,每組5只。實驗組于傷后3天,1周,2周,4周,6周和8周6個時間點取材。主要試劑:鼠抗鼠Bcl-2抗體、鼠抗鼠Bax抗體(中山生物技術有限公司),TUNEL試劑盒,SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.2 模型制備、取材與固定

10%的水合氯醛3ml/kg對大鼠腹腔麻醉,術區常規消毒,做右側臀部斜行切口,切開皮膚,鈍性分離肌肉,顯露坐骨神經。假手術組暴露坐骨神經后逐層縫合皮膚。實驗組在梨狀肌下緣處將坐骨神經完全切斷,在12倍手術顯微鏡下,將其兩端正確對位后,9-0無損傷線吻合斷端4針,閉合創口,制成坐骨神經切斷模型。取材:將各時間點5只大鼠腹腔麻醉后,4%多聚甲醛緩沖液心臟灌注固定,切取L4-L6段脊髓,置于5ml 4%多聚甲醛緩沖液中固定,脫水后石蠟包埋,制成厚度為3 μ m的連續橫斷切片備用。免疫組織化學法(SP法)檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達,TUNEL法檢測運動神經元的凋亡,使用濃度及方法嚴格按照說明書配置。

1.3 陽性結果判定及統計學分析

從假手術組及損傷后各時間點組隨機選取5張切片,在顯微鏡下觀察Bcl-2、Bax免疫陽性反應細胞在各組大鼠脊髓的分布,通過圖像分析系統進行半定量分析,以平均光度作為Bcl-2、Bax表達的定量指標,以數密度作為TUNEL法檢測的定量指標。采用SPSS17.0軟件進行統計學分析,運用單因素方差分析檢驗Bcl-2及Bax表達量在各時間點數值的不同是否有統計學意義,P＜0.05認為差異有統計學意義,并對Bcl-2/Bax值與細胞凋亡數之間進行相關分析。

2 結果

2.1 TUNEL染色結果

陽性細胞的胞核呈暗褐色。傷后3天時陽性細胞數較為稀疏,2周時陽性細胞最為稠密,圖像分析系統分析結果顯示,凋亡細胞的數密度在3天開始上升,2周時達高峰,以后有所下降,8周時仍有少量凋亡細胞。(見表1和圖3-4)

2.2 Bcl-2、Bax 表達結果

Bcl-2和Bax陽性定位于胞漿,呈棕黃色,核不著色。假手術組均未見明顯表達的陽性細胞。實驗組均于損傷后3天見陽性細胞,神經元和膠質細胞均有表達。圖像分析結果顯示,實驗組于3天開始表達量逐漸增高,2周時達高峰,此后逐漸下降,8周時仍有表達。(見表1和圖1-2)

2.3 Bcl-2與Bax比值

Bcl-2與Bax比值均先下降,2周時達到最低值,然后逐漸增高。各時間點Bcl-2與Bax比值進行方差分析,結果顯示,2周時Bcl-2與Bax比值的降低與其它組相比有統計學意義。(見表1和圖5)

表1 大鼠坐骨神經切斷傷后不同時間點Bcl-2/Bax與凋亡細胞數密度值(n=5,±s)

表1 大鼠坐骨神經切斷傷后不同時間點Bcl-2/Bax與凋亡細胞數密度值(n=5,±s)

Bcl-2/Bax比值與其它時間點比較,*P＜0.05

Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax TUNEL 3 d0.213±0.0130.175±0.0191.217±0.017 0.92±0.22 1 w 0.217±0.0210.181±0.0161.199±0.005 4.69±0.24 2 w 0.227±0.0120.199±0.0211.141±0.019*10.49±0.24 4 w 0.203±0.0090.169±0.0081.201±0.010 6.38±0.17 6 w 0.201±0.0110.165±0.0181.218±0.027 5.29±0.09 8 w 0.199±0.0120.163±0.0191.221±0.021 4.36±0.16

圖1 大鼠坐骨神經切斷后兩周Bcl-2的免疫組化染色(×200)

圖2 大鼠坐骨神經切斷后兩周 Bax的免疫組化染色(×200)

圖3 大鼠坐骨神經切斷后兩周脊髓神經元凋亡的免疫組化染色(×200)

圖4 大鼠坐骨神經切斷后不同時間點脊髓運動神經元凋亡計數

圖5 大鼠坐骨神經切斷后不同時間點Bcl-2/Bax平均光度比值

3 討論

周圍神經損傷后脊髓及背根神經節內神經元的存活與功能狀態是目前研究的熱點問題之一。凋亡是神經元死亡的重要形式。Atlasi等[2]將Wistar大鼠坐骨神經切斷后,用外膜縫合法縫合,術后1周和12周通過免疫熒光和電鏡觀察,發現腰5背根神經節中的感覺神經元有數量的減少和凋亡形態的改變。各種不同原因導致的周圍神經損傷,脊髓前角運動神經元均存在不同程度的凋亡[3]。Bcl-2和Bax是互相拮抗的兩個基因,在細胞凋亡的調控中發揮著重要作用。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)是主要的抗凋亡基因,可以抑制多種途徑的凋亡。Bax(bcl-2 associated X protein)屬于Bcl-2基因家族的成員,是Bcl-2的拮抗基因,通過編碼相應功能蛋白而起作用[4]。Bax存在于胞漿中,接受凋亡信息后能夠被激活,激活后通過末端疏水結構域錨定在線粒體膜上,使線粒體通透性發生改變致使細胞色素C、凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptic protease activating factor-1,Apaf-1)釋放,進而激活caspase系統,促使細胞發生凋亡。當Bax通過BH3結構與Bcl-2形成復合體后則失去了改變線粒體膜通透性的作用而不能誘發細胞凋亡[5][6]。細胞是否凋亡還與Bcl-2和Bax比值相關。當Bcl-2、Bax基因啟動后,表現哪一方面的作用,主要依靠Bcl-2、Bax相對表達量的多少[7]。

本實驗結果顯示:假手術組Bcl-2、Bax均未見明顯著色,說明Bcl-2、Bax的表達與大鼠坐骨神經損傷密切相關。實驗組Bcl-2、Bax蛋白的表達均經歷一個先增高后下降的過程。傷后3天時即有Bcl-2、Bax表達并開始增高,于2周時達高峰,以后逐漸下降。我們看到隨著坐骨神經切斷損傷時間的延長,神經元細胞受損加重,凋亡級聯反應啟動,Bcl-2、Bax表達上升并于同一時間達到峰值。Bcl-2與Bax表達量的平衡變化與細胞凋亡的發生與否直接相關。Bcl-2與Bax比值結果顯示:各時間點中,3天時比值開始逐漸減小,2周時Bcl-2與Bax比值最小,以后比值逐漸增大。TUNEL染色結果發現:傷后3天即可見凋亡的神經細胞,2周時最多,以后逐漸下降,8周時偶可見TUNEL陽性細胞。Bcl-2和Bax比值與細胞凋亡檢測結果相比較,顯示出該比值與神經凋亡呈現出規律性的同步變化。本研究提示:大鼠坐骨神經切斷后相應脊髓節段內存在神經細胞的凋亡,Bcl-2和Bax比值的變化是神經凋亡的重要指標。

[1]楊 萍,應大君,宋 林,等.成年大鼠坐骨神經切斷后脊髓運動神經元死亡方式的研究[J].第三軍醫大學學報,2006,26(6):146.

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[3]Gu ZZ,Pan YC,Cui JK,et al.Gene expression and apoptosis in the spinal cord neurons after sciatic nerve injury.Neurochem Int 1997,30:417.

[4]Nesic-Taylor O,Cittelly D,Ye Z,et al.Exogenous Bcl-xL fusion protein spares neurons after spinal cord injury[J].J Neurosci Res,2005,79(5):628.

[5]Antignani A,Youle RJ.How do Bax and Bak lead to permeabilization of the outer mitochondrial membrane?[J].Curr Opin Cell Biol,2006,18(6):685.

[6]Er E,Oliver L,Cartron PF,et al.Mitochondria as the target of the proapoptotic protein Bax[J].Biochim Biophys Acta,2006,1757(9-10):1301.

[7]Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins:mechanisms,physiological roles,and therapeutic opportunities[J].Cell Death Differ,2006,13(8):1378.