急性淋巴細胞白血病患兒亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與甲氨蝶呤動態血藥濃度相關性的研究

許 宏,張亞南,康熙雄*

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科,北京100050;2.首都醫科大學附屬北京兒童醫院檢驗中心,北京100045)

白血病是兒童發病率較高的惡性腫瘤,其中以急性淋巴細胞白血病(ALL)最為常見,廣東省2003年-2004年0歲-18歲青少年惡性腫瘤流行病學調查,白血病位居第一位,年發病率1.36/10萬[1]。研究發現ALL與亞甲基四氫葉酸還原酶基因型突變相關[2].亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝途徑的限速酶,催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5甲基四氫葉酸,前者參與DNA合成和修復,后者參與DNA甲基化。MTHFR基因研究較多的2個基因多態位點分別為MTHFR C677T和MTHFR A1298C,這兩種基因突變可導致MTHFR活性不同程度減低,進而影響葉酸代謝。

甲氨蝶呤(methylaminopterin,MTX)是抗葉酸代謝藥物,大劑量甲氨蝶呤(high-dose methylaminopterin,HDMTX)是治療兒童急性淋巴細胞白血病的主要治療藥物,尤其在維持治療及防治髓外白血病中有著極其重要的作用。臨床觀察治療過程中相同劑量的MTX用在不同個體時患者的療效和毒副反應不同,不同的個體對MTX治療的敏感性及耐受性存在差異,推測葉酸代謝可能影響機體對MTX作用。本研究以ALL患兒為研究對象,探討MTHFR基因C677T和A1298C基因多態性與大劑量甲氨蝶呤化療期間的MTX動態血藥濃度的相關關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2009年6月-2010年2月在北京兒童醫院血液病房住院的初診并接受正規化療的ALL患兒35例,均經骨髓細胞學確診,其中男19例,女16例,年齡范圍在1.5歲-14歲之間,平均年齡5.5±3.6歲。35例患兒根據CCLG-ALL 2008方案臨床危險度分為兩組:標危組17例,其中男10例,女7例,年齡在2-7歲之間,平均年齡3.53±1.59歲。中危組18例,其中男9例,女9例,年齡范圍在1.5歲-14歲之間,平均年齡7.38±4.12歲。化療前血常規、肝、腎功能均在正常范圍內。所有患兒經VDLD誘導方案治療處于完全緩解狀態,應用HD-MTX進行鞏固及髓外白血病防治的治療。

1.2 HD-MTX用法 參見CCLG-ALL 2008方案,標危組采用MTX 2.0 g/m2·次,中危組采用MTX 5.0 g/m2·次,1/6量(不超過500 mg/次)在 30 min內快速靜脈滴入,余量在24 h內均勻滴入。化療期間檢測血常規、肝、腎功能,并常規對口腔黏膜、胃腸道以及重要臟器進行保護。化療后42 h用甲酰四氫葉酸鈣(CF)15 mg/(m2·次)解救,每6 h給藥 1次,共6-8次。同時檢測血清MTX水平,以調整CF的應用次數和劑量,直至血清MTX濃度＜0.1 μ mol/L時,停止CF解救。

1.3 MTX藥物濃度監測 經HD-MTX治療預防髓外白血病患兒于靜脈滴注MTX后24 h、48 h、72 h采對側上肢靜脈血2 mL,應用TDX熒光偏振免疫分析儀(FPIA,美國雅培公司)檢測MTX血藥濃度,MTX試劑由雅培公司提供。

1.4 外周血白細胞DNA提取 化療前抽取每個研究對象靜脈血2 ml,EDTA抗凝,提取外周血基因組DNA(愛思進生物技術有限公司)。

1.5 PCR擴增 PCR擴增目的片段的引物分別是MTHFRC677T:F1 5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3'和F2 5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'[3];MTHFRA1298C位點:F1 5'-CTT CTA CCT GAA GAG CAA GTC-3'和F2 5'-CAT GTC CAC AGC ATG GAG-3'[4](上海生工生物工程公司),產物分別為198 bp和256 bp。PCR反應體系含有模板DNA、上游和下游引物、dNTP、緩沖液 (mg2+plus)、Ampli-Taq酶(TaKaRa公司)。MTHFR C677T的PCR反應條件為:94℃4 min,94℃30 s、60℃60 s和 72℃60 s共 35個循環,72℃10 min。MTHFR A1298C的PCR反應條件為:94℃3 min,94℃30 s、56℃30 s、72℃60 s共35個循環,72℃5 min。應用MyCycler(BIO-RAD)儀器進行PCR。

1.6 酶切鑒定 取PCR產物與限制性核酸內切酶HinfⅠ(TaKaRa公司)或MboⅡ(TaKaRa公司)37℃溫浴2小時,3%瓊脂糖凝膠電泳判定基因型。

1.7 統計學分析 統計分析采用SPSS 11.5統計軟件。卡方檢驗比較不同基因型分布在性別和危險度分組的差異,單因素方差分析比較HD-MTX化療后MTHFR不同基因型間MTX血藥濃度的差異,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因型鑒定

Hinf I識別MTHFR C677T突變T位點,PCR產物酶切后共出現3種基因型(見圖1):野生型(CC)198 bp片段;純合變異型(TT)175 bp、23 bp片段;雜合變異型(CT)198 bp、175 bp及 23 bp片段。23 bp片段分子量太小,顯示不清楚。PCR產物經Mbo II酶切后MTHFRA1298C出現3種基因型(見圖1):野生型(AA)有 176 bp 、30 bp、28 bp、22 bp 四個片段 ;純合變異型(CC)204 bp、30 bp、22 bp三個片段;雜合變異型(AC)有 204 bp、176 bp、30 bp、28 bp、22 bp 五個片段。30 bp、28 bp、22 bp片段分子量太小,顯示不清楚。

圖1 mthfr基因 RFLP分析圖

2.2 MTHFR基因型分布

35例ALL的MTHFR C677T基因型分布為:野生型(CC型)4例,突變雜合型(CT型)18例,突變純合型(TT型)13例。低危組:野生型(CC型)2例,突變雜合型(CT型)6例,突變純合型(TT型)9例,中危組:野生型(CC型)2例,突變雜合型(CT型)12例,突變純合型(TT型)4例。MTHFRA1298C基因型分布為:野生型(AA型)25例,突變雜合型(AC型)10例。低危組:野生型(AA型)13例,突變雜合型(AC型)4例,中危組:野生型(AA型)12例,突變雜合型(AC型)6例。MTHFR A1298C基因型CC型未見。最常見的基因型組合是C677 TT/A1298AA(25.71%)和C677 CT/A1298 AA(22.86%),未檢出C677 TT/A1298 AC基因型(見表1)。MTHFR C677T以及A1298C基因型分布在臨床分組未見差異(分別為P=0.142,P=0.521)。

表1 35例ALL患兒MTHFR基因型臨床分組

2.3 MTHFR基因突變比率

35例ALL患兒中MTHFRC677T CT+TT基因突變率占88.57%,MTHFR A1298C AC+CC基因突變率占28.57%(表1)。

2.4 MTHFR基因型與HD-MTX化療后動態MTX濃度的關系

HD-MTX化療臨床危險度分組標危組和中危組的MTX動態血藥濃度24 h與48 h、72 h有顯著差異(P=0.002)(見表2)。MTHFRC677T基因型24 h的MTX濃度有顯著差異(P=0.017)(表3),CT型明顯高于CC型及TT型(P=0.025,P=0.016);48 h、72 h的MTX濃度未見差異(見表3)。MTHFR A1298C基因型之間24 h,48 h,72 h的MTX濃度未見差異(P＞0.05)(見表3)。

表2 HD-MTX化療后血清MTX濃度(±s mol/L)

表2 HD-MTX化療后血清MTX濃度(±s mol/L)

*P＜0.05

時間(h)治療前 24 48 72臨床危險度分組標危組 0.01±0.0228.41±19.920.33±0.25 0.20±0.19中危組 0.02±0.0261.61±33.531.17±1.34 0.39±0.59 P值 0.79 0.002* 0.02 0.40

表3 HD-MTX化療后MTHFR基因型MTX動態濃度(±s mol/L)

表3 HD-MTX化療后MTHFR基因型MTX動態濃度(±s mol/L)

*P＜0.05

HD-MTX化療后時間(h)基因型 ±s mol/L P值MTHFR C677T 24 CC 21.93±15.91 0.017*CT 59.45±35.03 TT 30.69±18.41 48 CC 0.83±0.61 0.957 CT 0.72±1.06 TT 0.84±1.24 72 CC 0.28±0.18 0.984 CT 0.33±0.62 TT 0.35±0.36 MTHFRA1298C 24 AA 45.70±34.93 0.613 AC 38.96±20.39 48 AA 0.85±1.23 0.539 AC 0.60±0.45 72 AA 0.37±0.57 0.507 AC 0.21±1.48

3 討論

MTHFR是研究癌癥基因多態性較好的基因之一,研究發現突變頻率較高的兩個多態位點是MTHFR C677T和A1298C。MTHFR基因多態性與急性淋巴細胞白血病的易感性是否相關尚有爭議。德國學者研究從1983到2003年出生人群未見MTHFR基因多態性與ALL相關[5]。但是,Sinnett研究MTHFR基因突變與ALL相關,突變基因型可降低ALL風險,具有保護作用[6],推測懷孕期間服用維生素的孕婦在各國之間的差異(從法國3%到美國90%)是影響研究結論的因素之一,即MTHFR與種族、地域、文化習慣等因素相關。MTHFR各基因型與ALL疾病相關程度也報道不一。我國學者江華等研究發現MTHFR 677CT/TT等基因多態性對兒童ALL的發生具有保護作用,有可能使兒童ALL發生的風險降低3倍,而MTHFR A1298C的各種基因型則與兒童ALL的發生間均無明顯相關性[7]。de Jonge等未發現MTHFR A1298C基因對ALL發生風險有任何預防作用,而其他基因還原葉酸載體基因(reduced folate carrier gene,RFC1)和尼克酰胺N-甲基化酶(nicotinamide N-methyltransferase,NNMT)基因多態性可增加ALL發生風險[8]。本研究對ALL患兒MTHFR基因多態性調查發現:①MTHFR保護基因TT/AC和TT/CC及風險基因TT/AA和CT/AA。Thirumaran等[5]調查 460例ALL和1472例對照組沒有 TT677/AC1298和TT677/CC1298基因型,本研究ALL也未見這兩種基因型,提示這兩型基因可能是保護基因。而最多見基因型TT677/AA1298(25.71%)和CT677/AA1298(22.86%),提示這兩型基因與其他基因型比較患病風險較高。②ALL患兒MTHFR CT+TT突變頻率比成人ALL高。MTHFR C677T CT+TT占88.57%,MTHFR A1298C AC+CC占29%,患兒的MTHFRC677T基因突變型高于成人(65.1%)(P=0.019),MTHFRA1298C基因突變型與成人(28.6%)(P=1.000)相似[9]。③MTHFR基因多態性與臨床根據CCLG-ALL 2008方案將病情危險度分組無差異(P＞0.05)。基因多態性與ALL病情嚴重程度無關。

關于MTHFR基因多態性與化療的敏感性及毒副反應關系也有相關報道。余慧等研究發現具有MTHFR 677 CT突變的個體對于MTX化療的毒副反應發生率較野生型明顯提高,前者的毒副反應發生風險為后者11.3倍[10]。劉晶霞等研究結果顯示HD-MTX化療對擁有MTHFR C677 TT等位基因患者的毒副作用高于攜帶MTHFR 677 TC等位基因的野生型基因型[9]。然而,Samart等發現MTHFR C677T變異在ALL患兒接受HD-MTX治療時沒有增加MTX導致的毒性的風險性。MTHFR 1298CC基因型降低骨髓抑制的風險性[11],A1298C與MTX毒副反應相關[12]。本研究MTX用藥按照ALL診療建議臨床危險度分組即標危組和中危組用藥劑量不同,在化療期間,患兒肝功、腎功等檢測指標均在正常參考范圍,未見基因多態性與MTX的毒副作用相關,關于MTHFR基因多態性對ALL患兒MTX毒副反應的影響還有待更多病例調查和進一步研究。HD-MTX化療期間MTX動態血藥濃度研究中發現MTHFR C677T基因型24小時的MTX濃度有差異,CT型明顯高于CC型及TT型。MTHFR 677CT和TT突變基因型的酶比活性分別為677C/C基因型的60%和30%[3]且MTHFRC677T TT基因型存在DNA低甲基化[13],四氫葉酸還原酶酶活性降低使葉酸生產減少,導致體內DNA甲基化異常,DNA甲基化異常影響MTX代謝,造成MTX在體內代謝緩慢,推測TT型比CT型代謝慢。而本研究提示甲氨喋呤在MTHFR 677C/T型代謝較緩慢,推測可能是一個位點突變對MTX代謝影響程度較大。

臨床用藥過程中觀察相同劑量的甲氨蝶呤用在不同的患者其毒副反應不一,不同患者對此藥的敏感性和耐受程度不同,基因多態性在個體分布差異是造成臨床療效不同的原因之一。監測MTX血藥濃度,根據血藥濃度作為調整甲酰四氫葉酸鈣解救MTX濃度調整CF的應用次數和劑量,對MTX清除緩慢患兒尤為重要,保證療效和減少甲氨喋呤毒副作用。隨著葉酸代謝途徑的研究進展,MTHFR基因多態性與ALL易感性關系的研究進展,為ALL個體化治療提供理論依據。臨床治療ALL前檢測MTHFR C677T基因型,預測個體對藥物敏感性,在HDMTX給藥和CF解救過程中監測和及時調整MTX濃度進行個體化治療。

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