酪氨酸-釤(Ⅲ)配合物與鯡魚精DNA的作用方式

趙娜，王興明，張艷，胡亞敏，丁立生

(1. 西南科技大學 材料科學與工程學院，四川 綿陽，621010；2. 中國科學院 成都生物研究所，四川 成都，610041)

氨基酸是人體內本身具有的不可缺少的生物物質，是人體內生物大分子蛋白質的基本組成單元，對人和動物的生長發育及其新陳代謝都有著重要的意義。其中酪氨酸一般在醫藥中作為甲狀腺功能亢進藥物，在許多合成反應中用作合成多肽類激素、抗生素和 L-多巴等藥物的主要原料，是一種重要的生化試劑。近年來，發現稀土在醫藥方面具有廣闊的應用前景，它們具有特殊的電子結構，一旦稀土金屬元素與配體配位不僅會降低稀土元素的毒性，還可以表現出其特殊的生理活性。例如，配合物與 DNA的某些親核基團(如磷酸氧位點或堿基氮、氧位點)直接螯合，引起癌細胞的DNA損傷，起到抗癌抑癌的作用[1]。同時，以氨基酸與稀土金屬形成的配合物作為抗癌藥物可能產生協同效應，從而提高藥物與人體的生物相容性和抗癌活性。目前，歐陽澤英等[2]采用了紫外光譜法、熒光光譜法和黏度法研究了二(2-苯并咪唑亞甲基)胺合鏑配合物與 DNA的作用，認為它是以靜電和部分插入模式與 DNA作用。曹惠平等[3]通過紫外光譜法、熒光光譜法和凝膠成像法研究了酚氧橋聯型雙核Eu(Ⅲ)配合物與DNA的作用，指出了它們之間存在插入作用。楊立榮等[4]僅采用熒光光譜和黏度法研究了3種銪()Ⅲ-牛磺酸席夫堿配合物與DNA的作用模式，認為它們與 DNA之間均存在插入作用。吳惠霞等[5]通過紫外光譜和循環伏安 2種方法研究了氨基酸-鈰配合物與小牛胸腺 DNA的作用，指出它們之間存在靜電作用，但該文獻未包含結合比和熱力學函數等參數的計算。另外，目前研究較多的是氨基酸-銅配合物與DNA的作用，而對氨基酸-稀土金屬配合物與DNA的作用研究較少。迄今為止，關于酪氨酸-釤配合物與DNA作用的研究尚未見報道，為此，本文作者除通過紫外光譜法、熒光光譜法綜合黏度法和Scatchard法對酪氨酸-釤()Ⅲ稀土配合物與鯡魚精DNA的作用進行較全面、系統的研究，還采用了摩爾比法、雙倒數法等測定計算熱力學函數和結合常數等相關作用信息。酪氨酸-釤()Ⅲ稀土配合物與鯡魚精DNA之間不僅存在溝渠作用，還存在嵌插作用。同時，舍棄了原有毒性較強的EB探針，采用相對環保型的AO作為探針，可望對了解抗癌藥物的抗癌機理及設計開發新型抗癌藥物提供有價值的信息[6]。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

儀器為：UNICO UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)；RF-540 熒光光譜儀(日本島津)；Nicolet 380型智力傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電尼高力公司)；Vario EL CUBE 型元素分析儀(德國元素分析系統公司)；pHS-2C型酸度計(成都方舟科技開發公司)；烏式貝德黏度計(上海市青浦縣前明玻璃儀器廠)；HH-601超級恒溫水浴(金壇金南儀器廠)。

試劑為：hsDNA(A.R，Sigma公司產品)；酪氨酸(Tyr，A.R，成都科龍化工試劑廠)；三氧化二釤( Sm2O3，A.R，北方方正稀土研究所有限公司產品)；吖啶橙(AO，A.R，成都科龍化工試劑廠)；乙二胺四乙酸鈉(EDTA，A.R，廣東光華化學廠有限公司)；其他試劑，均為分析純；水，為二次重蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1 配制Sm()ClⅢ3溶液

用濃鹽酸將Sm()Ⅲ2O3溶解，小火蒸發掉水和過量的鹽酸至白色粉末狀，加Tris-HCl緩沖溶液配制成一定濃度的Sm()ClⅢ3溶液。

1.2.2 光譜法測定

各種溶液均用 pH=7.40的 Tris-HCl緩沖溶液配制，搖勻，放置5 min。在1 cm比色皿中加入3.00 mL待測溶液，以Tris-HCl緩沖溶液空白為參比，用指定溶液進行滴定，掃描吸收光譜或熒光強度。激發和發射光譜掃描狹縫寬度均為5 nm，波長λex=441 nm。

1.2.3 黏度法

用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液配制DNA和不同濃度的Sm()(ⅢTyr)3-DNA溶液，放置24 h，在25 ℃恒溫水浴槽中用烏式貝德黏度計測定黏度。

2 結果與討論

2.1 酪氨酸-釤()Ⅲ配合物的合成

將三氯化釤與酪氨酸(先逐滴加入少量濃鹽酸使酪氨酸完全溶解)以物質的量比為1∶3的配比溶解在85 mL乙醇溶液中，在80 ℃水浴上加熱并不斷攪拌，調pH=3～5，在水浴中反應14 h，溶液變為淡黃色，濃縮液體至10 mL左右，靜置結晶，用無水乙醚洗滌數次，干燥后，得到晶體酪氨酸-釤()Ⅲ的配合物(Sm(Ⅲ)(Tyr)3·Cl3·H2O)[7]。IR(KBr壓片)：配合物羧基的對稱和反對稱伸縮振動位置(νs(COO-)=1 490 cm-1，νas(COO-)=1 600 cm-1)與相應單純的氨基酸比較有較明顯的變化，并且羧基的反對稱振動峰發生分裂，說明氨基酸以羧基的氧原子與金屬配位；Δ(νas(COO-)-νs(COO-))=110 cm-1，說明羧酸根可能以雙齒形式配位[8]。在3 440 cm-1處的峰為N—H伸縮振動峰；3 130 cm-1處的峰為O—H的伸縮振動吸收，由于酪氨酸分子間由氫鍵連接形成多聚體，氫鍵的締合導致羥基的伸縮振動峰發生了向低頻方向的位移，并形成寬闊的獨特圖形的吸收峰[9]；1 070 cm-1和1 140 cm-1處的峰為C—N的伸縮振動峰。元素成分分析結果如下：對于實驗值，C 41.03%，H 4.66%，N 5.15%，Sm 17.57%；對于理論值，C 39.19%，H 4.35%，N 5.08%，Sm 18.18%。

2.2 光譜法研究Sm()Ⅲ-Tyr與DNA的作用方式

2.2.1 Sm()Ⅲ對Tyr熒光光譜的影響及其結合比

Sm()Ⅲ對Tyr熒光光譜的影響見圖1。由圖1可知：固定Tyr的濃度，隨著Sm()Ⅲ濃度增加，Tyr在波長為519 nm處的熒光值逐漸升高，表明Sm與Tyr之間發生了相互作用[10]，可能形成了配合物。因此，固定Tyr的濃度，改變Sm()Ⅲ的濃度，在519 nm處測定熒光值，結果如圖 2所示，實驗測得 Sm(Ⅲ)與Tyr結合的Sm與Tyr物質的量比F為1∶3。

圖1 Sm(Ⅲ)對Tyr熒光光譜的影響Fig.1 Influence of Sm(Ⅲ) to fluorescence spectra of Tyr

圖2 Sm(Ⅲ)-Tyr的物質的量比F與c(Sm)/c(Tyr)的關系(519 nm)Fig.2 Relationship between molar ratio F and c(Sm)/c(Tyr)(519 nm)

2.2.2 DNA對Sm()Ⅲ(Tyr)3紫外吸收光譜的影響及其結合比

DNA對Sm(Ⅲ)(Tyr)3紫外吸收光譜的影響見圖3。由圖3可知：固定Sm(Ⅲ)(Tyr)3的濃度，隨著DNA濃度增加，Sm(Ⅲ)(Tyr)3在223 nm和277 nm處有明顯的增色效應，表明Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物與DNA分子之間相互作用[10-11]可能生成了復合物；同時，出現吸收峰藍移，其原因可能是 DNA與配合物的吸收峰發生疊加(DNA的2個主要吸收峰在210 nm和260 nm左右)，導致配合物吸收峰藍移。增色效應和減色效應的產生可能是由于配合物與 DNA結合之后，溶液中配合物聚集體以及配合物分子之間的氫鍵被破壞，導致配合物吸收強度發生改變。

圖3 DNA對Sm(Tyr)3紫外吸收光譜的影響Fig.3 Influence of DNA on UV-vis absorption spectra of Sm(Tyr)3 (pH 7.40)

圖4 DNA與Sm(Tyr)3的物質的量比(277 nm)Fig.4 Molar ratio plots of DNA and Sm(Tyr)3 (277 nm)

固定Sm(Ⅲ)(Tyr)3的濃度，改變DNA的濃度，在277 nm處測定吸收強度，結果如圖4所示。由圖4可見：實驗測得 Sm(Ⅲ)(Tyr)3與 DNA的物質的量比n(Sm(Ⅲ)(Tyr)3)∶ n(DNA)=3∶1。根據 Beer定律 A＝εbc，計算得到 Sm(Ⅲ)(Tyr)3-DNA的表觀摩爾吸光系數ε=2.70×105L/(mol·cm)。

2.3 雙倒數法測定結合常數和熱力學函數

采用化學熱力學方法分析Sm(Ⅲ)(Tyr)3與DNA的相互作用，可以更深刻地理解它們的作用情況。分別在 298.15 K和人體溫度 310.15 K下測定 DNA與Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物的作用。雙倒數公式為[12]：

式中：A0和A分別為加入DNA前、后溶液的吸光度；K為復合物的結合常數；c1為DNA的濃度。

對298.15 K和310.15 K時277 nm的相對吸收強度按式(1)進行數據處理，作雙倒數圖(圖 5)，所得直線截距和斜率求出 Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物的結合常數分別為L/mol。根據熱力學方程：

圖5 pH=7.40時1/(A-A0)與1/c(DNA)的關系Fig.5 Relationship between 1/(A-A0) and 1/c(DNA) at pH 7.40

2.4 以吖啶橙為探針研究Sm()Ⅲ(Tyr)3與DNA的作用方式

2.4.1 吖啶橙(AO)對 DNA-Sm(Ⅲ)(Tyr)3體系熒光光譜的影響

AO為一共軛平面稠環分子，能專一性地嵌插于DNA雙螺旋的堿基對之間而用作核酸的光譜探針。AO對DNA-Sm(Tyr)3熒光光譜的影響見圖6。由圖6可見：向DNA-Sm(Ⅲ)(Tyr)3體系中逐漸滴加AO溶液，隨著AO體積增加，DNA-Sm(Ⅲ)(Tyr)3體系在519 nm處的熒光強度逐漸增強。這是AO嵌插于DNA的結果[13]。

圖6 AO對DNA-Sm(Tyr)3熒光光譜的影響(pH=7.40)Fig.6 Influence of AO on fluorescence spectra of DNA-Sm(Tyr)3(pH=7.40)

2.4.2 配合物Sm(Ⅲ)(Tyr)3對DNA-AO體系熒光光譜的影響

Sm(Ⅲ)(Tyr)3對DNA-AO熒光光譜的影響見圖7。可見：向DNA-AO體系中逐漸滴加配合物溶液，隨著配合物體積的增加，DNA-AO體系在526 nm處的熒光強度逐漸減弱，說明 Sm(Ⅲ)(Tyr)3的加入破壞了原來DNA-AO體系平衡，Sm(Ⅲ)(Tyr)3與AO存在一定的競爭作用，爭奪DNA上的結合位點，將AO從DNA上擠出來，導致熒光強度降低。這說明配合物Sm(Ⅲ)(Tyr)3與DNA之間存在嵌插作用。

2.5 Scatchard法研究 Sm(Ⅲ)(Tyr)3與 DNA的作用方式

AO可以作為研究Sm(Ⅲ)(Tyr)3與DNA作用方式的熒光探針。在DNA-Sm(Ⅲ)(Tyr)3體系中滴加AO，引起熒光強度變化。因此，利用Sm(Ⅲ)(Tyr)3存在AO與DNA作用的Scatchard圖可判別配合物與DNA的作用方式。AO與DNA作用的特點可用Scatchard方程闡述：r/c2=K(n-r)(式中：r為每個核苷酸結合 AO的分子數；c2為AO游離濃度；n為r最大值；K為單個位點固有的結合常數)。

圖7 Sm(Tyr)3對DNA-AO熒光光譜的影響(pH 7.40)Fig.7 Influence of Sm(Tyr)3 on fluorescence spectra of DNA-AO (pH 7.40)

當 NaCl是否存在時，Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物與AO-DNA體系相互作用的Scatchard圖如圖8和圖9所示。由圖8和圖9可以看出：AO與DNA作用的Scatchard圖中各直線均出現拐點，這表明在Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物的存在下，AO與DNA的結合分2個階段：在AO體積較小的初始階段，DNA的一部分結合位點已被配合物占據，AO則采用非競爭方式占據DNA上剩余的位點，與DNA形成化合物，即在圖中斜率絕對值較大的那部分直線；隨著AO體積的增大，AO與DNA的結合達到飽和，由于Sm(Ⅲ)(Tyr)3配合物與DNA的結能力遠小于AO與DNA的結合能力，結合在DNA上的配合物分子將被多余的AO分子采用競爭方式從 DNA分子上擠出來，同時，結合在DNA上的AO與游離的AO分子發生相互作用，削弱了AO與DNA之間的結合，導致AO-DNA化合物穩定性降低，n增大，即圖中斜率絕對值較小的那部分直線[14]。

圖8 Sm(Tyr)3配合物與AO-DNA體系相互作用的Scatchard圖(無NaCl)Fig.8 Scatchard plots of AO-DNA in different concentrations of Sm(Tyr)3(without NaCl)

圖9 Sm(Tyr)3配合物與AO-DNA體系相互作用的Scatchard圖(有NaCl)Fig.9 Scatchard plots of AO-DNA in different concentrations of Sm(Tyr)3(with NaCl)

另外，溶液中有無 NaCl 2種情況的對比結果顯示：存在NaCl的n基本都大于不存在NaCl的n，說明 Sm(Ⅲ)(Tyr)3與 DNA之間存在溝渠作用，即Sm()Ⅲ(Tyr)3配合物與DNA溝區中的堿基對之間存在范德華力和氫鍵作用[15]。

2.6 黏度法研究配合物與DNA的作用方式

在缺少高精度晶體結構數據和核磁數據的情況下，黏度法作為對 DNA長度變化比較敏感的流體力學方法是檢測溶液狀態下配合物與 DNA作用模式的重要手段。含有平面芳香稠環的小分子以插入方式與DNA作用時，DNA相鄰堿基對的距離變大，以容納插入配體，并導致 DNA雙螺旋長度增加，從而增大溶液的黏度；當藥物分子以靜電、溝渠結合等非插入方式與DNA作用時，DNA溶液黏度無明顯變化；當藥物分子以部分插入模式與 DNA作用時，則可能使DNA堿基對的相對位置發生變化，導致雙螺旋發生扭結，使DNA黏度降低[6,16]。不同濃度的Sm(Ⅲ)(Tyr)3對 DNA黏度的影響見圖 10。可見：Sm(Ⅲ)(Tyr)3與hsDNA作用后黏度有所增加，進一步證實在本實驗條件下，Sm(Ⅲ)(Tyr)3與hsDNA之間存在嵌插作用[17-18]。

圖10 不同濃度的Sm(Ⅲ)(Tyr)3對DNA黏度的影響Fig.10 Influence of different concentrations of Sm(Ⅲ)(Tyr)3 on DNA viscosity

3 結論

(1) 通過摩爾比法，測得在生理 pH=7.40 時Sm(Ⅲ)(Tyr)3與DNA形成物質的量比為3∶1的復合物，表觀摩爾吸光系數為 ε= 2.70×105L/(mol·cm)。

(2) 由熱力學實驗測定和計算得到 Sm(Ⅲ)(Tyr)3與鯡魚精 DNA相互作用的結合常數為-2.86×104J/mol，配合物Sm(Ⅲ)(Tyr)3與鯡魚精DNA之間的作用為焓所驅動。

(3) Sm(Ⅲ)(Tyr)3與DNA主要是以嵌插方式和溝渠方式相互作用。溝渠作用是由于配合物通過 DNA分子中的大溝及小溝與堿基發生范德華力和氫鍵作用。嵌插作用是由于酪氨酸的分子結構中的羥基與苯環共平面，這可能是Sm(Ⅲ)(Tyr)3可以與DNA發生嵌插作用的內部結構原因。

致謝：

本文得到了西南科技大學分析測試中心的支持，在此表示衷心感謝！

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