基于對羥基桂皮醇的新型酶聯熒光免疫傳感系統測定布氏桿菌抗體

湛雪輝，周隨安，龔福春，李飛，曹芬，李俠

(長沙理工大學 化學與生物工程學院，湖南 長沙，410076)

由于酶聯免疫分析方法結合了酶的催化放大和免疫反應的特異性，具有分析靈敏度高和選擇性好的特點，在實際中得到了廣泛應用。基于辣根過氧化物酶(HRP)的酶聯免疫分析是其中應用最成功的方法之一[1-5]，該方法通常利用 HRP標記抗體/抗原，通過HRP催化H2O2氧化酶底物，生成不同二聚或多聚產物如醌式或偶氮類物質等。然后，采用分光光度、電化學或化學/電化學發光等方法測定酶催化產物的光/電信號，間接測定抗體/抗原或半抗原。因此，HRP酶底物體系決定了所選擇方法的靈敏性、檢測限及穩定性等性能。目前，HRP主要底物有苯二胺類[6]、氨基酚類[7]、聯苯胺類[8]以及由苯胺類衍生出來的一些偶氮染料[9]等，但是，這些底物存在以下不足：(1) 穩定性差，多數見光或在空氣中極易被氧化，底物保存困難，一般只能現配現用；(2) H2O2單獨氧化底物的信號強，體系背景信號較強；(3) 有的底物或反應產物對人類身體有毒害作用[10-11]，如偶氮染料、苯胺和苯二胺等。針對上述問題，本文作者對 HRP 底物進行研究。以兔布氏桿菌抗體為分析對象，建立了以對羥基桂皮醇為 HRP 底物的酶聯熒光免疫分析方法。該方法由于將 ELISA方法的酶的積累放大作用與熒光檢測相偶聯，與電化學方法和紫外-可見光度法相比靈敏度有較大提高。這種方法初步用于血清樣品測定，結果與其他方法所得結果相吻合，可以滿足臨床分析的要求。

1 實驗

1.1 儀器

HITACHI F4500熒光光譜儀，用于熒光測定；江蘇產蠕動泵，用于產生水流；重慶產CSS501型恒溫水浴槽，用于控制培育溫度。

1.2 試劑

辣根過氧化物酶(HRP，編號為EC 1.11.1.7, 比活力 RZ＞3)和對羥基桂皮醇(4-hydroxylcinnamic alcohol，HCA)，購于Sigma公司；微晶纖維素和石蠟，購于上海化學試劑公司；布氏桿菌抗原(BrAg)和布氏桿菌抗體(BrAb)，由湖南省生物與機電職業技術學院提供；1.00 mmol/L 對羥基桂皮醇儲備液：將2.31 mg對羥基桂皮醇(Sigma公司)溶于100 mL無水乙醇中，避光保存，使用時用pH=6.8的B-R 緩沖液稀釋。本實驗所用的其他溶液用二次蒸餾水制備。

1.3 酶標抗體(HRP-BrAb)的制備

在10 mL pH值為6.8的磷酸緩沖溶液(PBS)中加入適量的HRP(3.5 mg)和2 mL 體積分數為1%的戊二醛，充分混合，在室溫下培育12 h。將得到的溶液在溫度為4 ℃、濃度為10 mmol/L PBS和0.15 mol/L NaCl溶液(pH為7.2)中透析過夜。將溶解在1 mL pH值為9.6的由0.15 mol/L NaCl和0.1 mol/L Na2CO3組成的溶液中的BrAb(5 mg)與滲析過的HRP-戊二醛溶液混合，在4 ℃培育24 h。得到的溶液在10 mmol/L，pH值為7.2的PBS中透析。用Sephadose G-200柱凝膠過濾進一步純化，即得HRP-BrAb連結物(0.48 g/L)，于4 ℃儲存備用。

1.4 布氏桿菌抗原的固定

取5.5 mg BrAg和12 mg牛血清白蛋白(BSA)溶解在1.5 mL pH值為7.0的冷PBS中(4 ℃)，該溶液與0.9 g微晶纖維素粉充分混合，然后，將混合物置于干燥器中于4 ℃干燥。將吸附有BrAg-BSA的干粉與石蠟按質量比1∶1混合(石蠟事先溶解在乙醚中)，待乙醚揮發后(約5 min)，將得到的糊狀物擠壓進直徑為6 mm的聚氯乙烯(PVC)管中，管另一端是旋轉螺帽。生物組分—纖維素—石蠟支撐體的結構如圖1(a)所示。

1.5 生物組分—纖維素—石蠟支撐體的再生

通過旋轉螺帽使纖維素—石蠟—生物組分復合物層擠出約0.1 mm，用水潤濕后在三氧化二鋁砂紙(0.05μm)上拋光，用二次蒸餾水沖洗即可獲得更新的表面。

1.6 測定步驟

圖1 布氏桿菌抗體測定傳感體系Fig.1 Configuration of biocomposite support body and schematic diagram of injection system coupling with fluometry

酶聯熒光免疫分析程序如圖1(b)所示，操作步驟如下：第1步，將更新后的支撐體A放在5 mL含有100 μL HRP-BrAb(0.48 mg/L)和不同體積的 BrAb(分析物)組成的緩沖溶液(質量分數為 0.1% 的BSA，pH=7.5，0.1 mmol/L Tris-HCl)中培育30 min；第2步，培育后的支撐體用緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl-KCl，pH=7.5)充分沖洗，熒光測定前儲存在相同的緩沖液中；將處理好的支撐體安裝到流通反應池中。

含有2.5×10-7mol/L HCA底物溶液通過蠕動泵泵入反應池，測定激發光波長為315 nm 時467 nm 處HCA的熒光，加入一定量的 5×10-7mol/L H2O2于HCA溶液中，當含有HCA和H2O2的底物溶液流過支撐體表面時，連接在支撐體表面的 HRP-BrAb-BrAg復合物中的HRP催化H2O2氧化HCA，使一部分HCA轉化為強熒光的物質。通過測定 HCA底物溶液熒光強度的變化可定量測定樣品中的BrAb。

2 結果與討論

2.1 酶催化反應機理及定量基礎

對羥基桂皮醇(4-hydroxycinnamic alcohol，HCA)是廣泛存在于植物體內的天然活性成分，其中以肉桂皮和紫蘇油含量較高，它在植物體中通過氧化可以形成木脂素，還起到抗氧化作用[12-13]。本研究中將HCA用作HRP底物，在BrAb測定中起信號分子的作用，以HCA為底物的酶催化反應機理與文獻[14-16]中報道的類似，可以表示為如圖2所示機理：HCA只有很弱的熒光，當HRP催化H2O2氧化HCA時，生成自由基中間體，然后2個含自由基的中間體轉化為二聚體產物(強熒光物質)，體系熒光強度增加。

圖2 酶催化反應機理Fig.2 Mechanism of HRP-catalyzed reaction

在競爭免疫反應分析過程中，分析樣品中的BrAb和加入的標準溶液 HRP-BrAb競爭結合到固定的BrAg上。連接到支持生物組分表面的HRP-BrAb的量與分析樣品中 BrAb的量成反比，因此，樣品中BrAb(分析物)濃度與HCA溶液熒光強度增加成反比。這就是本方法進行免疫分析測定BrAb的基礎。

對 HCA-HRP-H2O2反應體系的熒光特性進行研究，結果表明：底物HCA在312 nm處僅有1個極弱的熒光發射峰(激發峰為 299 nm)。圖 3所示是HRP-BrAb催化H2O2氧化HCA的熒光光譜圖，可以看出：在底物HCA溶液中加入HRP-BrAb和H2O2后，酶產物在467 nm處有1個較大的熒光發射峰(激發波長為315 nm)，且在一定范圍內熒光增加與HRP-BrAb呈線性相關。

圖3 HRP-BrAb催化H2O2氧化HCA的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of HCA solution catalyzed by HRP-BrAb

2.2 降低支撐體表面非特異性吸附方法

因抗原抗體間的結合力較強，免疫傳感體系實際應用的主要障礙之一是生物反應表面再生困難。使用微纖維素-石蠟吸附和包埋 BrAg除了有利于保持活性外，支持體表面可通過簡單的拋光得到更新。為了降低HRP-BrAb與支持體表面的非特異性吸附，加入BSA可以占據微纖維素-石蠟基質多余的位點。微纖維素對HRP-BrAb和BrAb生物分子有相容性，有利于免疫反應。對微纖維素(Cellulose)與石蠟(paraffin)的質量比進行研究，表1所示是采用不同比例的纖維素和石蠟制備生物組分支持體獲得的熒光強度。由表1可知：在生物復合物中加入質量分數為 0.1% BSA能降低HRP-BrAb在支持體表面的非特異性吸附，表明BSA能與BrAb和 HRP-BrAb競爭占據基質表面的多余位點。實驗還表明：增加纖維素含量有利于提高一定量HRP-BrAb引起的熒光響應，但所記錄的信號不穩定。故本研究中纖維素/石蠟的質量比選定為1∶1。

表1 BSA對熒光強度的影響Table 1 Effect of BSA on fluorescence intensity

2.3 溶液pH的影響

除 HCA溶液本身的熒光強度易受 pH影響外，HRP-BrAb的活性和HRP-Ab-Ag復合物增加值的穩定性也受pH的影響。對pH對HCA溶液本身的熒光強度的影響進行研究，結果顯示：pH＜6時，熒光強度隨pH增加而增加，pH＞6時，呈下降趨勢。這可能是pH影響了HCA基態和激發態的平衡的原因。

對pH對HRP-BrAb的催化作用及HRP本身的影響也進行了研究，結果如圖4所示。可見：HCA酶催化反應的產物在可見區315 nm處有吸收峰，通過測定315 nm處的吸收峰可以估計酶催化反應活性；HRP-BrAb催化產物對紫外光的吸收隨 pH增加而增加，至pH=5.5時趨于穩定，在更高pH下，吸收趨于下降，表明催化反應的最佳pH為5.5，這與HRP直接催化反應的最佳pH略有不同(pH=5.0)，可能是HRP與帶電荷的BrAb交聯后使HRP-BrAb帶更多正電致使 pH低于酶反應的原始pH的緣故。但pH太低不利于BrAb與BrAg的緊密結合，當底物溶液流過生物復合物的表面時，將導致HRP-BrAb損失。因此，本研究中采用的pH為5.5。

圖4 pH對酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on activity of HRP

2.4 流速對熒光強度的影響

當HCA和H2O2被連續傳送到流通反應池中時，HCA和H2O2與HRP-BrAb接觸并發生反應，使測量體系熒光信號發生變化，底物的流動速度直接影響HCA和H2O2與HRP-BrA接觸機會。如圖5所示：底物溶液流速越低，熒光信號增加越大，但流速過低會使分析時間延長。本實驗中采用的流速為30 mL/h。

圖5 底物溶液流速對熒光的影響Fig.5 Effect of flow rate of substrate carrier solution on fluorescence

2.5 實驗參數的優化

圖6 所示為HRP-BrAb的用量對熒光強度的影響。可見：在5 mL包含有不同濃度的HRP-BrAb的培育液中，響應隨HRP-BrAb用量的增加而增加，至100 μL HRP-BrAb(0.48 mg/L)后趨于飽和。這是因為免疫傳感器表面抗原結合位點的量是有限的。因此，本實驗采用在5 mL培育液中加入100 μL HRP-BrAb為基本工作液。實驗表明：最佳培育溫度為 27 ℃，最佳培育時間為30 min。

2.6 傳感裝置的應用

圖7為測定BrAb的校正曲線。由圖7可知：底物溶液熒光強度和培育液中的 BrAb呈相關性，線性范圍為2.7～90 μg/L，檢測限為2.7 μg/L。此方法的檢測限低于用壓電免疫傳感方法的檢測限(7.2 μg/L)。

圖6 HRP-BrAb用量對熒光強度的影響Fig.6 Effect of amount of HRP-BrAb on fluorescence strength

圖7 BrAb測定的工作曲線Fig.7 Calibration curve for BrAb determination obtained by competitive immunoassay

以質量濃度為55 mg/L的BrAb作標準溶液測定此方法的重現性，結果和標準偏差見表2。由表2可知：該免疫傳感體系的重現性較高。

表2 免疫傳感方法的重現性Table 2 Reproducibility of immunosensing system

表2 Ⅰ組中的每一個數值代表1個生物組分支持體表面經過拋光、培育和熒光測定步驟后所測得的熒光增加值；培育中BrAb 的質量濃度為0.055 g/L。表2 Ⅱ組為用不同生物組分支持體的測定值。即用過的支持體在存放時間為1.5月后的更新表面的測定值。使用次數為68次，累計使用時間79 h(溫度為27 ℃)。

制備的免疫傳感裝置用于檢測被感染的兔血清樣品(湖南生物機電職業技術學院提供)，結果見表3。由表3可知：用此方法測定的結果與ELISA法測定的結果較吻合。所以，此法可用于檢測血清樣品中的BrAb。

表3 兔血清樣品中BrAb含量的測定Table 3 BrAb determination in rabbit serum samples μg/L

3 結論

基于新底物對羥基桂皮醇的酶聯熒光免疫分析方法與傳統測定 BrAb的免疫分析方法相比，具有較大優勢：

(1) 實現了酶聯熒光免疫傳感測定BrAb，靈敏度提高，實驗步驟大大簡化。

(2) 可進行支持生物組分表面更新，分析成本降低。

(3) 微纖維素-石蠟基質直接包埋完整細菌方法簡單，有利于布氏桿菌抗原活性的保持。

(4) 新底物為天然產物，對人體無毒害作用。這種方法對其他免疫試劑測定也有借鑒作用。

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