隱藏嗜酸菌DX1-1和氧化亞鐵硫桿菌CMS的紫外誘變育種及浸礦研究

楊宇，張帥, 徐愛玲, 鄒俐宏, 歷麗, 邱冠周

(中南大學 資源加工與生物工程學院，生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙，410083)

近年來，在極端環境下生長的微生物，由于其特殊的生理學和生態學的特征，受到了廣泛關注[1]，特別是能氧化礦物的微生物，它們能通過生理生化反應利用礦物產生鐵離子和硫酸，后者是浸礦反應中的關鍵因素[2]。這些微生物能夠利用鐵和硫的氧化產生能量，屬于化能自養的細菌或古菌[3]。迄今為止，在硫化礦坑廢水中僅得到了幾個種屬的具有鐵和硫氧化能力的細菌[4-5]，包括 Leptospirillum ferrooxidans,Acidithiobacillus ferrooxidans在內的嗜酸[6]和耐酸自養菌屬以及嗜酸異養菌，其中，又以氧化亞鐵硫桿菌Acidithiobacillus ferrooxidans(At. ferrooxidans)的氧化能力最為突出，在自然界浸出硫化礦中扮演重要角色，被廣泛地應用于生物濕法冶金[7-8]。相對而言，鐵的還原能力被認為可以加快含鐵礦物如黃鉀鐵礬和針鐵礦的溶解。具有這種能力的細菌有中等嗜溫異養菌，如隱藏嗜酸菌Acidiphilium spp.，該菌不能氧化二價鐵[9]。又如Sulfobacillus spp.，該菌既不能氧化二價鐵又不能還原三價鐵[10]。所有的Acidiphilium spp.( Ac. cryptum.)都能通過異化作用使三價鐵還原成二價鐵，區別在于這種能力在一些菌株中是由結構決定的，另一些則是誘導產生的[11]。浸出反應常由上述氧化菌屬催化，但是產量較低。原因包括如下 3個方面：(1) 生長速率緩慢；(2) 細胞濃度低；(3) 三價鐵在氧化過程中被抑制[12]。這些不足亟需在生物浸出過程中得到解決。

誘變育種作為一種有效地提高微生物代謝產物產量的手段得到了廣泛應用，紫外線是一種非電離輻射，能使被照射物質的分子或原子中的內層電子提高能級躍遷到能量高的外層軌道(稱為激發)，導致分子的理化變化。DNA分子上的堿基對強烈吸收紫外線，而且嘧啶比嘌呤敏感100倍。紫外線輻射能引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內和分子間的交聯、核酸與蛋白質的交聯，以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，但最主要的則是形成嘧啶二聚體，它會阻礙雙鏈的解鏈和復制，阻礙堿基的正常配對，從而導致基因突變。它的遺傳效應主要是引起 GC→AT 的轉換或移碼突變[12]。在At. ferrooxidans的DNA中，AT堿基的含量為46%～47%[13]，而Ac. cryptum中AT堿基的含量為37%～40%，可能形成胸腺嘧啶二聚體，從而容易誘導產生突變。

1 材料和方法

1.1 培養基和菌種

本試驗所用原始菌株 At. ferrooxidans CMS(DQO062118)和 Ac.cryptum DX1-1(DQ529311)由江西德興銅礦的酸性礦坑廢水(AMD)中分離得到[14]。在自然環境中，生長pH=2.0，溫度為21 ℃，細菌密度為6×109個/L，二價銅離子的質量濃度為 0.1 g/L。表明這2株菌具有氧化含銅硫化礦的能力，并具有銅離子耐受能力。

9K 基礎培養基成分(質量濃度)如下：(NH4)2SO43 g/L， KCl 0.1 g/L， K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Ca(NO3)20.01 g/L。

CMS所用9K發酵培養基初始pH值為2.0 并加入4.5% FeSO4作為能源。

DX1-1所用9K發酵培養基初始pH值為3.0，并加入1.5%葡萄糖作為能源。

9K固體培養基為 9K發酵培養基+1%瓊脂粉，pH=3.5～4.5。

1.2 活菌計數

連續稀釋培養基，在適宜菌體濃度下通過血細胞計數板進行鏡檢計數。

1.3 隱藏嗜酸菌DX1-1和氧化亞鐵硫桿菌CMS的紫外誘變

菌株在發酵培養基里擴大培養，收集對數生長期的菌體，洗滌，用無菌水制備成菌懸液，菌體密度N為107～108個/mL。取10 mL菌懸液放入9 cm平皿中，經磁力攪拌后置于 15 W 紫外燈下 30 cm處進行照射，照射時間分別為30, 60, 120, 180和240 s，設立平行對照組。各取1 mL溶液稀釋，涂9K平板計算致死率。另取1 mL溶液接種到添加了0.3% LiCl的9K發酵培養基。LiCl的作用是為了增強誘變效果。在4 ℃避光保藏12 h后，在30 ℃避光培養36 h。Ac. cryptum DX1-1的正突變率由傳代時間決定，At. ferrooxidans CMS的正突變率由亞鐵離子氧化率決定。At.ferrooxidans CMS的亞鐵離子氧化率通過在250 mL錐形瓶里加入 100 mL 9K基礎培養基+30 g/L FeSO4·7H2O (6.08 g/L Fe2+)，在 30 ℃，pH=2.0 條件下培養測定。在初始階段，每10 h取樣檢測Fe2+質量濃度；在中后期，每3 h取樣檢測Fe2+質量濃度。

1.4 礦樣

試驗所采用的礦樣使用前經過粉碎并用丙酮和乙醇洗滌[15]。礦樣成分(質量分數)為：CuFeS260.8%，FeS220.7 %，CaCO38.4%，SiO24.6%。

1.5 生物浸出試驗

在250 mL錐形瓶里加入100 mL含硫化礦的 9K基礎培養基(在硫化礦浸出試驗中不加入亞鐵)，礦含量為5%[16]。通過離心收集細菌，用硫酸調至pH=2.0的蒸餾水洗滌2次，再用9K基礎培養基懸浮，不加入能量物質，試驗溫度為30 ℃，初始pH=2.5。設計6個試驗組，每組做3個平行試驗：(1) 培養基中接種誘變后Ac. cryptum DX1-1；(2) 培養基中接種誘變前At. ferrooxidans CMS；(3) 培養基中接種誘變后 At.ferrooxidans CMS；(4) 將誘變前2株菌按數量比1∶1混合接種；(5) 將誘變后2株菌按數量比1∶1混合接種；(6) 對照組(不接菌)。每種菌的接種量為1 mL，菌體密度為1×107個/mL左右， 同時調節搖瓶內浸出環境。

1.6 分析方法

水樣的物化性質分析由中南大學分析檢驗中心測定，金屬離子用原子吸收光譜法測定，pH值由pH計(pHs-25)測定，銅離子在30 d內的浸出量通過原子吸收光譜法測定，亞鐵離子的氧化率通過重鉻酸鉀化學滴定法測定，致死率通過平板計數法測定，Ac. cryptum DX1-1 和At. ferrooxidans CMS的正突變率分別由傳代時間和亞鐵離子的氧化率決定。

1.7 生物浸礦后期浸出液的微生物群落組成分析

1.7.1 DNA的提取和純化

將試驗樣品浸出液通過孔徑為 0.2 μm的尼龍過濾器過濾收集細菌。DNA 提取使用 EZ-10 Spin Column Genomic DNA Isolation Kit (Bio Basic Inc) 試劑盒，純化使用 Wizard DNA Clean-Up Kit (Promega)試劑盒。

1.7.2 擴增16S rRNA

采用2個引物擴增16S rRNA基因片斷，上游引物為 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；下游引物為 1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。通過低熔點瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結果，使用Wizard DNA Clean-Up Kit (Promega)試劑盒回收目的片斷。將16S rRNA基因片斷連接到PCR2.1 TOPO載體上，轉化到E. coli TOP10F感受態細胞內(Invitrogen)。轉化后重組菌涂LB瓊脂平板37 ℃過夜培養，LB瓊脂平板加入氨芐青霉素、X-gal和IPTG，通過藍白篩選，隨機挑取 60個白色菌落，使用載體引物M13F(5′-GTAAAACGACGGCCAGTG-3′)和 M13R(5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′)，將攜帶重組質粒的細菌破壁，進行菌落PCR擴增。

1.7.3 限制性片斷長度多態性分析(ARDRA)

16S rRNA PCR擴增產物經 HindI和 MspI(Fermentas) 37 ℃酶切過夜，3.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外光下觀察 ARDRA結果，與文獻[17]中進行比較分析。

2 結果與討論

2.1 酸性礦坑廢水的理化分析

酸性礦坑廢水成分如表1所示。從表1可見：硫的質量濃度為4 401.00 mg/L，已經被證實可以作為Ac.cryptum DX1-1的能源物質[15]；Fe3+具有同樣功效，這也是Ac. cryptum DX1-1可以促進生物浸出的主要原因。采集AMD樣品時，pH=2.0，溫度為21 ℃。

表1 酸性礦坑水成分分析Table 1 Composition of AMD ρ/(mg·L-1)

2.2 細菌的生理生化特征

pH值和溫度對Ac. cryptum DX1-1生長的影響如圖1所示，可見：最適pH=3.5，最適生長溫度為30 ℃。pH和溫度對At. ferrooxidans CMS生長的影響如圖2所示，可見：最適pH=2.0，最適生長溫度為30 ℃。由于2種菌有不同的最適pH值以及At. ferrooxidans CMS在浸礦中起主要作用，所以，在浸礦試驗中取pH=2.5。

2.3 紫外誘變結果

2.3.1 Ac. cryptum DX1-1的紫外誘變結果

Ac. cryptum DX1-1的致死率和正突變率如表2所示。從表2可見：致死率與照射時間成正比，以細菌在穩定期具有比原始菌株更大的菌體密度為正突變指標。60 s時的致死率為75%，正突變率為16.7%，為最佳誘變時間。從正突變菌株中選取傳代時間最短的菌體用于浸出試驗。

Ac. cryptum DX1-1誘變前和誘變后的生長曲線如圖3所示。可見：誘變后正突變菌株達到穩定期的時間為80 h，比原始菌株提前了20 h，菌體密度也由原來的109個/mL上升到1010個/mL。

圖1 pH值和溫度對Ac. cryptum DX1-1生長的影響Fig.1 Effects of pH and temperature on growth of strain Ac. cryptum DX1-1

圖2 pH值和溫度對At. ferrooxidans CMS生長的影響Fig.2 Effects of pH and temperature on growth of strain At. ferrooxidans CMS

表2 紫外誘變對Ac. cryptum DX1-1的影響Table 2 Effect of UV-induced mutagenesis on Ac. cryptum DX1-1

2.3.2 At. ferrooxidans CMS的紫外誘變效果

At. ferrooxidans CMS的致死率和正突變率如表3所示。從表3可見：At. ferrooxidans CMS的致死率與照射時間成正比，以細菌具有比原始出發菌更高的亞鐵氧化率為正突變指標，60 s時的致死率為73%，正突變率為20.0%，因此，60 s為最佳誘變時間。

圖3 Ac. cryptum DX1-1誘變前和誘變后的生長曲線Fig.3 Growth curves of Ac. cryptum DX1-1 before and after UV-induced mutagenesis

表3 紫外誘變對At. ferrooxidans CMS的影響Table 3 Effect of UV-induced mutagenesis on At. ferrooxidans CMS

從正突變菌株中選取氧化亞鐵能力最強的菌株用于浸出試驗。At. ferrooxidans CMS誘變前后的亞鐵氧化率曲線如圖4所示?？梢姡赫T變后的正突變菌株氧化全部亞鐵所需時間為 48 h，較誘變前菌株縮短了11 h。

圖4 At. ferrooxidans CMS誘變前后的亞鐵氧化率Fig.4 Fe2+ oxidation rates of strain At. ferrooxidans CMS before and after UV-induced mutagenesis

最佳的紫外照射時間取決于細菌自身的特性及基因的特異性，試驗表明：對于At. ferrooxidans CMS 和Ac. cryptum DX1-1，采用低劑量的紫外誘變更為適合。因為中高劑量紫外誘變會造成大量基因嚴重損傷，這些基因的功能得不到及時修復就會導致負突變產生。尤其在低溫避光條件下，修復酶的活性受到限制，細菌的繁殖速度同樣受到了抑制，使得突變菌被分離和純化。

2.4 生物浸出試驗

黃銅礦作為酸溶性金屬硫化礦，易與三價鐵發生親核反應而被溶解[18-21]。三價鐵氧化黃銅礦在溶液中生成銅離子、二價鐵離子和元素硫，反應方程式如下：

At. ferrooxidans能夠氧化在浸礦過程中產生的亞鐵離子，反應式如下：

At. ferrooxidans能夠將上述過程中產生的硫氧化，反應式如下：

另外，在生物浸出過程中，也對電勢敏感，黃銅礦在硫酸溶液中的動力學原理如下：

硫在化學浸出過程中(式(1))形成，又在生物浸出過程(式(3))中被氧化。

從以上反應中不難看出：At. ferrooxidans有利于反應的持續進行。在生物浸出的初始階段，需要向搖瓶內加入硫酸使pH值維持在 2.5左右，提供所需的酸性環境；6 d以后，由于硫的氧化以及三價鐵水解成pH值會不斷下降。

在生物浸出過程中，會形成黃鉀鐵礬和硫的混合物，作為副產物在礦物表面形成一個層狀結構，阻礙黃銅礦的溶解[23]。Acidiphilium能在很大程度上降低Fe3+-(氫)氧化物包括黃鉀鐵礬、鐵礬、無定型氫氧化鐵和混合Fe2+/Fe3+磁鐵礦的形成[11]。Acidiphilium的加入溶解了礦物表面致密的層狀結構，有利于銅離子的持續浸出。

選用Ac. cryptum DX1-1和 At. ferrooxidans CMS浸出黃銅礦，結果如圖5所示?？梢姡涸谡麄€浸出過程中，銅離子的浸出質量濃度持續上升，在前15 d，銅離子的浸出質量濃度快速增大，在 16～30 d，質量濃度增大速度減慢；前15 d是生物浸出銅的主要階段，銅離子質量濃度大幅度上升，同時也產生了大量的黃鉀鐵礬和硫的混合物，阻礙了黃銅礦的溶解，因此，15 d后，銅離子的浸出趨于緩慢。接種了誘變后的Ac.cryptum DX1-1的浸出體系中，30 d后銅離子的質量濃度為0.52 g/L。接種了誘變前的At. ferrooxidans CMS的浸出體系中，30 d后銅離子的質量濃度為1.82 g/L，誘變后的體系中為 1.89 g/L。接種了誘變前的 At.ferrooxidans CMS 和 Ac. cryptum DX1-1(數量比為 1∶1)的浸出體系中，浸出30 d后銅離子的質量濃度為2.48 g/L，誘變后的混合體系中，30 d后銅離子的質量濃度達到 2.78 g/L。紫外誘變育種有助于提高 At.ferrooxidans的亞鐵氧化活性，有利于生物浸出。

圖5 不同浸出體系Cu2+質量濃度Fig.5 Cu2+ concentrations extracted in different systems

從試驗結果可以看出，使用2種菌混合浸礦的效果大于2種菌單獨浸礦效果，說明混合浸出是一個相互促進的過程。Ac.cryptum 加快了還原溶解黃鉀鐵礬和針鐵礦，并且消耗了抑制At. ferrooxidans生長的有機化合物，促進了At. ferrooxidans的浸礦過程。由于Ac. cryptum不能氧化亞鐵[24]，所以，它單獨浸礦的效果最差。

2.5 生物浸出后浸出液內生物群落結構分析

在生物浸出反應的初始階段，Ac. cryptum DX1-1和At. ferrooxidans CMS具有相同的細胞濃度。浸出30 d后，在接種了誘變前混合菌的浸礦體系中，經過限制性片斷長度多態性(ARDRA)分析，浸出液中 Ac.cryptum DX1-1和At. ferrooxidans CMS的數量比約為1∶20，在相同條件下，接種了誘變后混合菌的浸出礦體系中，它們的數量比為1∶18。這證明了Ac. cryptum不是浸礦過程的優勢菌，只占菌落結構的小部分，協助At. Ferrooxidans起浸礦作用。因此，可以在以后的試驗設計中更多考慮有利于 At. Ferrooxidans浸礦的因素，并在浸出體系中接種少量的Ac. cryptum。

3 結論

(1) 試驗中所選用的 Ac. cryptum DX1-1 和 At.ferrooxidans CMS的最適生長溫度均為 30 ℃，最適pH值分別為3.5和2.0。

(2) 紫外誘變 Ac. cryptum DX1-1和 At.ferrooxidans CMS最佳時間為60 s，正突變率分別達到16.7%和20.0%。誘變后的Ac. cryptum DX1-1達到穩定期的時間比誘變前縮短了20 h，并且具有更大的菌體濃度。誘變后的At. ferrooxidans CMS較誘變前具有更強的氧化亞鐵能力，將氧化全部亞鐵所需時間縮短了11 h。

(3) 誘變后的 At. ferrooxidans CMS 和 Ac.cryptum DX1-1(數量比為1∶1)混合浸礦，30 d后銅離子質量濃度達到2.78g/L，優于At. ferrooxidans CMS單獨浸礦或誘變前混合菌的浸礦效果。Ac. cryptum單獨浸礦的效果最差。

(4) 浸出 30 d后，Ac. cryptum DX1-1和 At.ferrooxidans CMS的數量比由1∶1變為1∶20左右，為以后的生物浸礦試驗設計提供了科學依據。

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