廣西巴馬壯族長壽老人 p16基因甲基化

陳文成 潘尚領 覃志堅 韋葉生 何印蕾 林偉雄

(右江民族醫學院醫學檢驗學院臨床微生物學和免疫學教研室,廣西 百色 533000)

人的壽命與環境因素和遺傳因素均有很大的關系,其中惡性腫瘤是老年人易患的直接關系到壽限的疾病之一,而腫瘤的發生與機體的抑癌基因關系密切。p16基因是一種重要的抑癌基因,在細胞周期過程中扮演著非常重要的角色,p16基因缺失或突變已被證實是許多腫瘤發生的原因之一〔1〕。近年研究表明 p16基因與細胞衰老有著緊密的聯系。本文旨在探討健康巴馬壯族長壽老人 p16基因甲基化程度,進一步揭示其與長壽的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 長壽組 (LG)156例,年齡 90～105歲 (12名≥100歲),平均年齡 93.2歲,男 46例,女 110例。對照組 (CG)142例均為健康成年人,年齡 20～72歲,平均年齡34.8歲,男 57例,女 85例。研究對象均為居住在巴馬縣(主要是甲篆、鳳凰、西山等鄉鎮)和東蘭縣 (主要是城關、長樂、武篆、三石等鄉鎮)的壯族人,據家譜均可逆查 8代以上。LG老人均為巴馬縣長壽研究所和東蘭縣老干局老齡辦建檔并長期隨訪的對象。CG為同一地理區域內無血緣關系、隨機抽樣的成年人,生活習慣及勞動條件與 LG組均基本相同。每個實驗對象采靜脈血 2 ml,加ACD抗凝,用經典的苯酚/氯仿抽提法提取白細胞 DNA〔2〕。用 TE溶液溶解DNA樣本置 4℃待用。

1.2 主要試劑 引物設計參照文獻〔3〕的報道,甲基化及非甲基化引物擴增片斷長度分別是150 bp和 151 bp,由上海生工生物工程技術有限公司合成。p16甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3′;下游 5′-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3′,p 16非甲基化引物序列:上游 5′-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3′;下 游 5′-CAACCCCAAACCACAACCATAA-3′。 dNTPs、Taq DNA聚合 酶 (含 10 ×buffer、MgCl2)、小牛血清(BSA)、二甲亞砜(DMSO)等均為華美公司產品。DNA Marker為宕生物工程有限公司產品。瓊脂糖為西班牙進口,由上海Yito Enterprise有限公司分裝提供。

1.3 實驗方法 按照 Herman等〔4〕描述的甲基化特異性 PCR(methylation specific PCR,MSP)方法,并參考文獻 〔5〕進行 p16基因甲基化的檢測,其原理是DNA雙鏈變性解鏈后在亞硫酸氫鈉作用下堿基C轉化成U,但對于已發生甲基化的C則無此改變,據此設計兩對不同引物進行 PCR擴增即可檢測出此差異。步驟如下:①DNA修飾。取 50μl(2μg)經 TE溶液溶解 DNA樣品,加入新配的 3 mol/L NaOH 5.5μl,42℃水浴 30min。加入新配的 10 mmol/L氫醌 30μl和 3.9 mol/L亞硫酸氫鈉 (Sigma公司)510μl,加少許石蠟避光 55℃水浴16 h。②DNA純化。采用Wizard DNA純化系統 (Promega),將去針頭的注射器針管固定于純化柱上,將上述 DNA與 1ml純化樹脂混勻后轉移至注射針管,加活塞輕推,同法用 2 ml 80%異丙醇洗滌 1次,14 000 r/min離心純化柱2min。加50μl預熱滅菌雙蒸水于純化柱 (65℃),室溫放置 1 min,13 000 r/min離心2 min,棄純化柱。加入 5μl新備的 3 mol/L NaOH,42℃水浴15 min,加入乙酸銨 (終濃度 3mol/L)、1μl糖原 (10 g/L)和三倍體積的無水乙醇,-20℃過夜。14 000 r/min 4℃離心20min,70%乙醇洗滌,加50μl雙蒸水溶解備用。

1.3.1 PCR 反應體系為 25μl,每個反應體系分別加入上述兩對引物;PCR反應條件為:94℃預變性 4 min→94℃變性1 min→59.8℃退火 1 min→72℃延伸 1 min,進行 33個循環反應。

1.3.2 電泳 基因擴增后以 8μl PCR反應產物在 2%瓊脂糖凝膠上電泳,電流 45 mA,電壓 100 V,電泳載樣緩沖液為1×TBE緩沖液,電泳后,在紫外光透射儀上觀察,攝片并記錄結果。甲基化引物擴增有 150 bp條帶說明該基因發生了甲基化,非甲基化引物擴增有 151 bp條帶則說明該基因未發生甲基化。

1.4 統計學處理 長壽組和對照組的各基因頻率比較分析用χ2檢驗,用 SPSS軟件包進行分析。

2 結 果

LG組 p16基因甲基化率明顯低于 GC組(P＜0.05)。對男女分別比較后,LG組 p16基因甲基化率亦明顯低于 GC組(P＜0.05),見表 1。

表1 p16基因甲基化分布的長壽組與對照組比較〔n(%)〕

3 討 論

抑癌基因與細胞衰老有著密切的關系,p16基因是目前研究較多的腫瘤抑制基因之一,其缺失與許多腫瘤有關〔6〕。p16屬于 INK 4a/ARP位點的腫瘤抑制基因,位于染色體 9p21,其編碼蛋白是 CDK4抑制物。近年研究表明 p16基因還與細胞衰老有著緊密聯系,p16的大量失活是誘發細胞衰老及腫瘤的一個重要原因之一。研究表明,p16的主要作用是特異地抑制細胞周期素 D-細胞周期素依賴性交合體對細胞 G1期到 S期的調控,當其缺失或失活時,交合體則持續高活性的存在于細胞內導致 PRB基因的磷酸化,釋放轉錄因子E2F等,激活多種細胞增殖的相關因子〔7〕,從而導致細胞 G1期到 S期的失控,細胞發生異常增殖,導致最后的惡變。

隨著研究的深入,人們認識到基因的甲基化修飾同基因缺失、突變一樣,也是腫瘤發生、發展和細胞衰老凋亡調節的重要因素。目前對 DNA甲基化的研究還處在起步階段,DNA甲基化的發生原因及確切機制還有待于進一步研究。甲基化是p16基因失活的重要機制,p16基因 5-CpG島甲基化已被證實與p 16的失活有密切的關系〔8〕。其機制可能與啟動子區高甲基化導致的 p16基因沉默有關。

廣西巴馬縣是著名的世界第五長壽之鄉,國內很多學者對該地區的長壽人群進行了大量的研究〔9〕,但是關于遺傳因素方面的研究很少。本研究表明,長壽組 p16基因甲基化比對照組低;對男女分別比較后,長壽組 p16基因甲基化比對照組低。而兩組中女性 p16基因甲基化均比男性高,說明不同性別人群p 16基因甲基化程度是不一樣的,研究衠明,長壽與性別之間存在相關關系,人類長壽顯示明顯的母系遺傳傾向〔10〕。雖然女性的長壽與其生理特點、社會生活習慣及生活環境等有很密切的關系,但是,不可否認的是遺傳因素在其中也起了很重要的作用。本研究結果提示 p16基因甲基化和不同性別的長壽人群有一定關系,可能正是由于長壽老人 p16基因甲基化率低,使得p 16基因失活少,從而減少患癌癥等影響壽命的疾病的機會。由于遺傳因素在體內的作用極其復雜,因此,要想弄清楚其在長壽中的具體作用機制并非一朝一夕的事,仍然需要作更進一步的研究。

p16基因甲基化與衰老的關系密切,對長壽人群體內這些基因的深入研究將有助于對抗衰老過程中抑制腫瘤發生的全面理解。另外,抗衰老過程中伴隨著抑制腫瘤的機制,因此,對細胞衰老的研究也將為癌癥的預防和治療方法研究提供更為廣闊的前景。

1 Esteller M,Corn PG,Baylin SB,et al.A gene hypermethylation profile of human cancer〔J〕.Cancer Res,2001;61(8):3225-9.

2 盧圣棟.現代分子生物學實驗技術〔M〕.第 2版.北京:中國協和醫科大學出版社,1993:108.

3 Kim YS,Kim JS,Jung HC,et al.Regression of low-grade gastric mucosaassociated lymphoid tissue lymphoma after eradication of Helicobacter pylori:possible association with p16 hypermethylation〔J〕.J Gastroenterol,2002;37(1):17-22.

4 Herman JG,Graff JR,Myohanen S,et al.Methylation-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(18):9821-6.

5 劉曉穎,汪惠園,魯 云,等 .p16基因甲基化特異檢測方法的建立及其初步應用〔J〕.安徽醫科大學學報,2002;37(1):18-21.

6 Warltatmbe T,Nakamura M,Yonekawa Y,et al.Promoter hypermethylation and homozygous deletion of the p19ARFand p 16INK4a genes in oligodendrogliomas〔J〕.Act Neuro pathol,2001;101(3):185.

7 Ahmad T,Gore M.Review of the use of topotecan in ovarian carcinoma〔J〕.Expert Opin Pharmacother,2004;5(11):2333-40.

8 Kang GH,Lee S,Kim JS,et al.Profile of aberrant CpG island methylation along the multistep pathway of gastric carcinogenesis〔J〕.Lab Invest,2003;83(5):635.

9 余祥美.巴馬縣 29名高齡老人細胞遺傳學分析〔J〕.中華老年醫學雜志,1982;1(20):70-3.

10 Perls T,Kunkel L,Puca A.The genetics of aging〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2002;12(3):362-9.