COX-2基因在大腸癌的表達及其意義

王淑強 李秀娟 李 鵬 武 欣 王琳冬

(河北北方學院病理教研室,河北 張家口 075000)

近年來研究表明,環氧合酶(COX)-2在多種腫瘤中均呈高表達,在腫瘤發生、發展、分化、轉移中起重要作用。在細胞癌變過程中,Wnt通路異常變化可能具有重要作用,COX-2是 Wnt通路的靶基因,可通過增強 MMPs的表達,促進腫瘤的轉移〔1〕。本研究采用流式細胞術檢測大腸癌及大腸遠端正常黏膜中COX-2的表達情況,探討COX-2在大腸癌發生、發展和轉移中的作用,為預測大腸癌浸潤和轉移提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集手術切除的大腸癌標本 58例,男 28例,女 30例,年齡 30～78歲(平均 58.3歲)。病變部位:結腸癌 22例,直腸癌 36例;分化程度:高分化腺癌 26例,中分化腺癌 20例,低分化腺癌 6例,黏液腺癌 6例;轉移情況:有淋巴結轉移31例,無淋巴結轉移 27例。同時選取大腸癌遠端正常黏膜組織 10例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 兔抗人 COX-2單克隆抗體(Santa Crus Biotechonlogy,INC),羊抗兔IgG-FITC,DAB顯示劑,均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 實驗步驟 單細胞懸液的制備:石蠟包埋組織 HE染色,切成 40μm厚的組織片 5片,放入 10ml的試管中,加入二甲苯 8 ml,在室溫下脫蠟 2d,其間更換 2次二甲苯,石蠟脫凈后,棄去二甲苯;依次加入 100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 ml,每步 10 min,加入蒸餾水 5 ml,10 min后棄之。加入2 ml 0.5%胰蛋白酶 (pH1.5)消化液,置 37℃恒溫水浴中消化30 min,在消化期間,每隔 10 min用振蕩器振蕩 1次,消化30 min后,立即加生理鹽水終止消化,經 300目尼龍網過濾,未消化好的組織可做第二次消化。收集細胞懸液,以1 500 r/min離心沉淀 5 min,再用生理鹽水漂洗 2次,以800r/min離心沉淀 5 min,去碎片。細胞的免疫熒光標記:取單細胞懸液 1×106/ml,加入兔抗人COX-2單克隆抗體工作液0.1ml室溫孵育 30 min,加入 PBS 10 ml洗滌 1次,棄上清,加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 10 ml,避光室溫孵育30 min,加入 PBS 10ml,800 r/min離心沉淀 5min,棄上清除去未結合的熒光二抗,上機檢測并加入PBS 0.1 ml經 500目銅網過濾后上機檢測。蛋白免疫熒光標記物測定設一抗或二抗的本底對照和陰性對照。檢測條件及參數采用美國 Beckman Coulter公司生產的 Epics-XLII型流式細胞儀,應用 Expo32ADC軟件分析數據。測定前以Flow check標準微球調整儀器的 CV值在 2%以內。

1.2.3 結果判定 根據流式細胞儀分析軟件測定出的平均熒光強度(Mode值)計算熒光指數(FI),并以 FI表示 COX-2基因蛋白表達的強弱。FI=(樣品基因蛋白的表達熒光強度 -正常樣品的熒光強度)/正常樣品的熒光強度。

1.3 統計學處理 數據分析采用 SPSS11.0統計軟件進行統計分析。數據用 x±s表示,采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 COX-2基因在正常黏膜和不同分化組中的表達 COX-2表達平均 FI值正常黏膜組為 1.00±0.28,高、中、低分化及黏液腺癌組分別為 2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43,高、中、低分化及黏液腺癌組 COX-2表達均明顯高于正常黏膜組(P＜0.01)。

2.2 COX-2基因在大腸的表達與臨床病理特征的關系 見表1。大腸癌COX-2基因表達在有淋巴結轉移組顯著高于無淋巴結轉移組(P＜0.05),與大腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發生部位等無關。

表1 COX-2基因在大腸癌中的表達與臨床病理特征的關系(x±s)

3 討 論

人的 COX-2基因定位于第一號染色體 1q25.2-25.3,長約8.3kb,其 mRNA約 4.5 kb,由 10個外顯子和 9個內含子構成;COX-2基因的 3URT區域包含 1.5 kb的 22個 AUUUA基因序列,與 mRNA不穩定有關〔2〕。 COX-2基因編碼 604個氨基酸,含 17個氨基酸殘基的信號肽。COX是一種與生物膜相結合的花生四烯酸轉化為前列腺素過程中發揮作用的限速酶。COX-2基因為誘導型蛋白,被認為是“快速反應基因”,靜息時不表達,當細胞受到各種刺激時則迅速合成,表達增加癌癥的發生是原癌基因激活和抑癌基因失活為基礎的多步驟、多階段過程,通常其表達產物作用于細胞生長、分化及代謝過程,最終導致癌變。COX-2在多種腫瘤如食管癌、腎癌、胰腺癌等組織中均有表達,研究表明,它在腫瘤的增殖、凋亡及轉移中發揮重要作用。COX-2促進腫瘤的發生和腫瘤的惡性表型轉換的可能機制〔3〕:(1)對細胞凋亡的抑制:可通過減弱和抑制 NO信號途徑來抑制細胞凋亡。(2)促進腫瘤血管的發生:血管內皮細胞通常不會增生,除非受到某些刺激,腫瘤血管的形成是針對不同因子的刺激而發生。VEGF作用于血管內皮細胞,通過增高血管內皮細胞滲透性和促進內皮細胞變形、遷徙等促進腫瘤血管生成〔4〕。研究證實,COX-2表達與 VEGF的表達呈正相關〔5～7〕。(3)促進腫瘤細胞的侵襲和轉移:COX-2高表達還常導致一種浸潤抑制因子 E-cadherin在細胞中缺失,E-cadherin缺失有利于腫瘤細胞的侵襲轉移。(4)調節免疫抑制功能。(5)導致原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突變:COX-2在正常大腸黏膜中檢測不到,而在 80%的大腸癌中呈過表達。Lambropoulou等〔8〕發現,在子宮內膜癌中 COX-2的表達與肌層浸潤深度密切相關,提示 COX-2表達與腫瘤的局部擴散有關。姚楠〔9〕研究顯示,COX-2在大腸腺癌的發展過程中其表達呈增高趨勢,提示COX-2在大腸腺癌的發展過程中起著重要作用。本研究顯示,正常黏膜組 COX-2表達平均 FI值明顯低于高、中、低分化組,提示 COX-2可能在大腸癌的發生、發展過程中發揮著重要作用。同時還顯示,淋巴結轉移組 COX-2表達平均FI值顯著高于無淋巴結轉移組,提示 COX-2的高表達預示著大腸癌患者有較高的淋巴結轉移率,而淋巴結轉移是影響大腸癌患者預后的重要指標,但COX-2的表達與患者的年齡、性別、發生部位、分化程度等無關。

1 青 軼,王 欣.酪蛋白酶 1在 Wnt通路和生物節律中的研究進展〔J〕.醫學分子生物學雜志,2005;2(4):274-7.

2 王勤章.環氧化酶-2及其在泌尿系腫瘤中的研究進展〔J〕.國外醫學?泌尿系統雜志,2002;22(5):274-7.

3 Demplce W,Rie I,Grothey A,et al.Cycbooxygenase-2:a novel target for cancer chemotherapy〔J〕.Cancer Res Clin Oncol,2001;127(7):411-7.

4 Krysan K,Reckamp KL,Dalwadi H,et al.Prostaglandin E2 activates mitogen-activated protein Kinase/Erk pathway signaling and cell proliferation in non-small cell lung cancer cells in an epidermal growth factor receptor-independent manner〔J〕.Cancer Res,2005;65:6275-81.

5 Timoshenko AV,Chakraborty C,Wangner GF,et al.COX-2 mediated stimulation of the lymphangiogenic factor VEGF-Cin human breast cancer〔J〕.Br JCance,2006;94:1154-63.

6 Soumaoro LT,Uetake H,Takagi Y,et al.Coexpression of VEGF-C and COX-2 in human colorectal cancer and its association with lymph node metastasis〔J〕.Dis Cobn Rectum,2006;49(3):392-8.

7 Kyzas PA,Stefanou D,Agnantis NJ.COX-2 expression correlates with VEGF-Cand lymph node metastasis in patients with head neck squamous cell carcinoma〔J〕.Mod Pathol,2005;18(1):153-6.

8 Lambropoulou M,Alexiadis G,Limberis V,et al.Chinicopathologic and prognostic significance of cyclooxygenase-2 expression in endometrial carcinoma〔J〕.Histopathology,2005;20(3):753-9.

9 姚 楠,李俊剛,高 倩,等.環氧化酶-2在大腸癌中的表達特點及其與淋巴結轉移的關系〔J〕.昆明醫學院學報,2006;27(5):55-9.