C纖維在電針口面部穴位鎮痛效應中的作用

劉健華 符文彬 徐振華 劉雪芳 陳杰斯

(廣東省中醫院針灸科 廣東省中醫院針灸效應規律及機制重點研究室,廣東 廣州 510120)

筆者的前期研究工作表明,電針口面部的四白穴對內臟功能活動具有顯著的調節作用〔1,2〕,孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)是其重要的延髓初級中樞〔3〕。在此基礎上,進一步研究發現生理狀況下 C纖維可能是針刺四白穴的感覺傳入的主要途徑〔4〕。四白穴位于眶下孔,受三叉神經下頜支的分支眶下神經的支配。因此,本研究通過辣椒素選擇性損毀眶下神經的 C纖維,觀察病理狀況下電針四白穴對內臟痛大鼠的鎮痛效應,探討電針口面部穴位鎮痛作用的傳入途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用體重 180～220 g的成年SD大鼠30只,雌雄不限,由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。隨機分為空白組、內臟痛組、電針 +內臟痛組、辣椒素 +電針+內臟痛組、溶媒 +電針 +內臟痛組,每組 6只。空白組大鼠腹腔注射生理鹽水;內臟痛組大鼠腹腔注射乙酸造成內臟痛模型;電針 +內臟痛組先電針雙側四白穴20 min(疏密波,2～20 Hz,強度以肉眼可見大鼠局部組織顫動為度),再腹腔注射乙酸造成內臟痛模型;辣椒素+電針+內臟痛組大鼠首先用辣椒素處理雙側眶下神經,術后 5 d待其完全恢復后電針雙側四白穴20 min(刺激參數同前),再腹腔注射乙酸造成內臟痛模型;溶媒 +電針 +內臟痛組大鼠用溶媒處理雙側眶下神經,其余處理同辣椒素 +電針 +內臟痛組。

1.2 試劑與儀器 c-fos免疫組化試劑盒(美國 Santa Cruz)、SABC免疫組化試劑盒(北京中山生物有限公司)、DAB顯色試劑盒(北京中山生物有限公司)。CM1850恒冷箱切片機(德國Leica),G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫用電子儀器廠)。

1.3 穴位定位 采用比較解剖學進行大鼠穴位定位。四白穴位于眶下緣眶下孔凹陷處。

1.4 造模方法

1.4.1 內臟痛模型 大鼠清醒狀態下腹腔注射 0.6%乙酸(10ml/kg)造成大鼠內臟痛模型,引起典型的腹部肌肉收縮,同時伴有一側后肢外伸〔4〕。

1.4.2 眶下神經的處理 10%烏拉坦(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后,手術游離出雙側眶下神經約 1 cm,將浸泡在 1.5%辣椒素的棉條包繞在眶下神經上。為防治藥液浸潤周圍組織,在其下墊一大小合適的塑料薄膜,20 min后去除棉條和塑料薄膜,縫合切口。溶媒對照組則用浸泡在溶媒(不含辣椒素的20%吐溫 80的石蠟溶液)中的棉條包繞在眶下神經上,其余處理與辣椒素組相同。

1.5 觀察指標

1.5.1 扭體反應 腹腔注射生理鹽水或乙酸后觀察并記錄60 min內大鼠腹部收縮次數。

1.5.2 c-fos表達 各組動物經處理后存活 2h,開胸經升主動脈插管進行灌流。先用 0.9%生理鹽水 100 ml快速沖洗血液,然后用含 4%多聚甲醛的 0.1 mol/LPB(p H7.4)400 ml灌注固定 50～60 min。灌注完畢后立即取延髓,置于上述灌流液中后固定 4～6h,再移入 20%蔗糖 PB中過夜(4℃)至組織塊沉底。次日取出組織做連續冠狀切片,片厚 40μm,切片隔兩張取一張,分數套收集于 0.01 mol/L PBS(pH7.4)中。進行免疫組織化學反應。①切片首先入0.03%的H2O2溶液中,室溫 30 min;②入 0.3%TritonX-100,室溫 30 min;③封閉用 10%正常羊血清,室溫 20 min;④多克隆兔抗 c-fos血清(1∶100,Santa Cruz),置于濕盒中(4℃)冰箱中過夜;⑤用生物素標記的羊抗兔 IgG(工作液,北京中山生物有限公司),室溫 1 h;⑥辣根酶標記鏈酶卵白素復合物 S-A/HRP(工作液,北京中山生物有限公司),室溫 1 h;⑦DAB呈色,室溫 3～5 min。上述各步驟之間(第三步除外)均用 0.01mol/L(pH7.4)PBS洗滌 3次,每次 5 min。切片裱于涂有明膠的載玻片上,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。室溫晾干后,光鏡下觀察、計數。空白對照用PBS替代兔抗 c-fos血清進行上述免疫組織化學反應。替代對照用兔血清稀釋液替代兔抗c-fos血清進行上述免疫組織化學反應。

1.6 統計學方法 每只大鼠隨機選取 6張切片,光鏡下計算每張切片孤束核和三叉旁核c-fos陽性神經元的數目。實驗數據以x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,全部數據輸入計算機用 SPSS10.0for Windows軟件進行處理。

2 結 果

2.1 扭體反應 大鼠腹腔注射 0.6%的乙酸后,引發典型的內臟痛行為反應 (扭體反應),即腹部肌肉收縮,同時伴有一側后肢外伸。腹腔注射生理鹽水,大鼠不出現扭體反應。電針四白穴預處理后 (電針 +內臟痛組),由內臟痛引發的腹部收縮次數明顯減少,與內臟痛組比較有顯著差異 〔(43.2±11.19)vs(88.0±16.66),P＜0.01〕;辣椒素處理雙側眶下神經后 (辣椒素+電針 +內臟痛組),大鼠腹部收縮的次數較電針 +內臟痛組明顯增加 〔(80.7±13.28)vs(43.2±11.19),P＜0.05〕,與內臟痛組大鼠相似 〔(80.7±13.28)vs(88.0±16.66),P＞0.05〕;溶媒處理眶下神經后,大鼠腹部收縮的次數較內臟痛組明顯減少 〔(44.3±11.1)vs(88.0±16.66),P＜0.05〕,與電針 +內臟痛組相似〔 (44.3±11.1)vs(43.2±11.19),P＞0.05〕。

2.2 NTS的 c-fos表達 腹腔注射乙酸誘發NTS大量的c-fos表達,其陽性神經元主要分布在 NTS的內側亞核、中間內側亞核以及連合亞核。電針四白穴預處理后(電針+內臟痛組),內臟痛所致 NTS的c-fos表達明顯減少,與內臟痛組比較有顯著差異〔(45.2±5.85)vs(60.4±5.47),P＜0.05〕;辣椒素處理雙側眶下神經后(辣椒素 +電針 +內臟痛組),NTS的 c-fos表達較電針 +內臟痛組明顯增加〔(68.5±10.26)vs(45.2±5.85),P＜0.01〕;溶媒處理后(溶媒 +電針 +內臟痛組),NTS的 c-fos表達與電針 +內臟痛組比較無明顯變化〔(50.2±7.02)vs(45.2±5.85),P＞0.05〕。見圖 1。

圖1 各組大鼠NTS的 c-fos表達(×200)

2.3 三叉旁核(paratrigeminal nucleus,PTN)的 c-fos表達 腹腔注射乙酸后,PTN可見少量的 c-fos陽性神經元;電針四白穴預處理后(電針 +內臟痛組),PTN的 c-fos表達較內臟痛組明顯增加〔(22.3±4.72)vs(6±1.32),P＜0.01〕;電針四白穴預處理后(辣椒素 +電針 +內臟痛組),PTN的 c-fos表達較電針 +內臟痛減弱〔(11.7±2.44)vs(22.3±4.72),P＜0.05〕;溶媒處理后(溶媒 +電針 +內臟痛組),PTN的 c-fos表達較辣椒素組顯著增加〔(26.3±4.50)vs(11.7±2.44),P＜0.01〕,與電針 +內臟痛組比較無明顯變化〔(26.3±4.50)vs(22.3±4.72),P＞0.05〕。見圖 2。

圖2 各組大鼠PTN的 c-fos表達(×200)

3 討 論

迄今為止人們對疼痛的了解大多來自軀體痛而非內臟痛,長期以來一直認為內臟痛只是軀體痛的一種變化而已。因此,針刺鎮痛的研究也大多以軀體痛為主。辣椒素局部神經干給藥能選擇性毀損初級傳人 C纖維,對有髓纖維影響小,而對運動纖維幾乎無影響,是選擇性研究傳入 C纖維的一種非常理想的工具藥。不少學者通過辣椒素處理支配穴位局部的傳入纖維,對C纖維在針刺鎮痛中的作用進行廣泛的探討。劉鄉等〔5〕將辣椒素作用于大鼠一側的腓總神經后,電針足三里對中縫大核神經元傷害性反應的抑制作用明顯減弱。辣椒素處理后24 h,電針患側足三里對痛反應已無明顯抑制,但電針對側足三里仍表現出明顯的鎮痛效應,表明 C纖維在針刺鎮痛中起重要作用。朱麗霞等〔6〕在辣椒素處理的新生大鼠身上觀察到,針刺遠離疼痛部位穴位的鎮痛作用明顯減弱,針刺疼痛局部的穴位仍有鎮痛作用,表明針刺遠神經節段穴位的鎮痛作用需要 C纖維的參與。方宗仁等〔7〕研究發現,辣椒素處理骨神經后電針足三里和三陰交抑制脊髓背角神經元晚成分放電的效應明顯減弱。徐嶸等〔8〕也同樣用辣椒素處理大鼠坐骨神經,發現電針環跳穴的鎮痛效應作用明顯。因此,傳入 C纖維在針刺鎮痛中有重要作用。但也有學者對此提出異議。包虹等〔9〕將辣椒素作用于大鼠坐骨神經 45min后,觀察到電針足三里和三陰交對脊髓背角廣動力神經元的抑制作用無明顯影響,因此認為 C纖維不是電針鎮痛的主要傳入纖維,而是彌散傷害抑制性控制(DNIC)的傳入纖維。

筆者的前期研究表明,辣椒素處理支配四白穴的眶下神經后,電針四白穴誘導三叉神經脊束核尾側亞核Ⅰ～Ⅱ板層的 cfos表達明顯減弱〔4〕,提示 C纖維可能是四白穴針刺信息的主要傳入途徑。本研究中,在內臟痛大鼠身上觀察到辣椒素處理眶下神經后,電針四白穴的鎮痛作用明顯減弱。因此,C纖維在電針口面部穴位鎮痛效應中發揮重要作用。

此外,本研究中還觀察到電針四白穴顯著抑制內臟痛大鼠NTS的c-fos表達,辣椒素處理后此抑制作用也明顯減弱,且PTN的 c-fos表達亦減弱,提示 NTS和PTN參與電針四白穴的鎮痛作用。

NTS接受Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ對腦神經的一般和特殊的內臟傳入纖維,是內臟感覺傳入的重要中繼站。來自內臟的機械、化學等多種傷害性刺激主要通過迷走神經直接上傳至 NTS〔10,11〕。筆者的前期工作也表明胃擴張和電針口面部穴位均誘導NTS的c-fos表達〔12〕,細胞外記錄的結果進一步證實 NTS存在對口面部的軀體刺激和胃擴張的內臟刺激同時起反應的神經元〔13〕。因此,NTS是內臟感覺傳入和面口部穴位的軀體感覺傳入匯聚及整合的重要中樞。

PTN主要通過包括眶下神經、下牙槽神經、咬肌神經、耳顳神經等接受頭面部的軀體傳入〔14～16〕。PTN與 NTS之間有廣泛的傳出纖維聯系,PTN投射至 NTS的纖維終末與直接與接受胃腸等內臟感覺初級傳入的終末區在 NTS內相互重疊〔17〕。神經束路示蹤研究表明,PTN存在著中繼三叉神經初級傳入并將之向NTS投射的神經元,提示三叉神經和NTS之間存在由二級神經元組成的傳入通路〔18〕。因此,口面部的軀體感覺傳入通過 C纖維經PTN中繼后與內臟的感覺傳入在 NTS發生匯聚并進行整合,這可能是電針四白穴對內臟痛產生鎮痛作用的機制。

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