si RNA沉默 Annexin-1基因對膀胱癌 T24細胞順鉑耐藥的影響

高 琳 楊遠航 徐萬海 林相國 李建章 楊德君 王曉民

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院泌尿外科,黑龍江 哈爾濱 150001)

膜聯蛋白-1(Annexin-1)是上皮生長因子(EGFR)激酶的主要底酶,糖皮質激素刺激其產生和活性。Annexin-1增強感染局部的凋亡表明它對腫瘤的診斷和治療有重要意義,因此提出該蛋白質與腫瘤細胞的活性調節相關〔1,2〕。Annexin-1與膀胱癌發生、發展密切相關。本研究針對 Annexin-1基因 mRNA序列設計合成與之互補的雙鏈小分子干擾 RNA(siRNA),在脂質體介導下轉染膀胱癌T24細胞系,觀察對 Annexin-1基因 mRNA和蛋白表達及對順鉑敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 膀胱癌T24細胞株。

1.1.2 主要試劑 RNA干擾試劑盒(SilencerTMsiRNA Construction Kit)購自美國 Ambion公司。陽離子脂質體轉染試劑盒 LipofectamineTM2000、Trizol、M-MLV購自 Invitrogen生命技術公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自 Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計及合成 根據基因庫中 Annexin-1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和 siRNA設計原則,應用 Ambion生物公司的設計軟件(siRNA Target Finder and Design Tools),自 Annexin-1 mRNA的起始密碼子開始,尋找“AA”二連序列,記下其 3′端的 19個堿基序列作為候選的 siRNA靶序列。將候選序列在基因庫中用 Blast軟件進行同源序列搜索,排除那些和其他基因編碼序列或基因表達序列標簽(EST)同源的候選序列。最終選擇了 3段 21個堿基的siRNA序列(TⅠ 、TⅡ 、TⅢ),分別靶向 Annexin-1基因的 240-260(SⅠ),435-455(SⅡ)和 506-526(SⅢ)區域(表 1)。另外,根據轉染后細胞形態學變化,設計與 TI(240 siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機對照 siRNA(240c1,240c2)做為陰性對照,用 Blast驗證隨機序列與基因庫中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(β-actin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為 RNA干擾實驗的陽性對照。設計的正反義寡核苷酸模板 3′端均加上 T7啟動子引物 5′CCTGTCTC3′,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 引物的設計與合成 設計了 1對 Annexin-1的引物,序列:上 游:5′-GACCACCTCAACTCAAGGAC-3′, 下 游:5′-AGGAAGCTGGATGAAGAGAC-3′,擴增片段長度 546 bp,同時設計了 1對管家基因 β-actin的引物作為內參照,序列:上游:5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′, 下 游:5′-AGAGGTCCTTACG-GATGTCAACG-3′,擴增片段長度為 290 bp,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 細胞培養 常規 RPMI1640培養,至轉染前夜,細胞培養液更換為用無血清和無抗生素的 IMDM,置于 37℃、5%CO2孵箱,轉染后用 20%胎牛血清(FBS)IMDM培養液,按常規方法培養,取處于對數生長期的細胞用于實驗。用 Opti-MEMⅠ轉染液及脂質體LipofectamineTM2000轉染試劑,按試劑盒說明優化轉染條件,分別將 3對 siRNA和陽性對照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNA-neg)以 400 nmol/L的終濃度加入細胞培養液,孵育 24、48、72 h后收獲細胞進行檢測。實驗重復 3次。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測轉染前后膀胱癌 T24細胞 Annexin-1 mRNA的表達水平 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA,用 2μg總 RNA進行 cDNA的合成,半定量 RT-PCR方法檢測siRNA轉染后不同時間點 24、48、72 h細胞中 Annexin-1 mRNA表達水平的變化,β-actin作內對照。PCR擴增條件Annexin-1:95℃預變性 5 min;94℃變性 40 s,58℃復性 1 min,72℃延伸1 min,共 33個循環;72℃延伸 10 min。 β-actin:94℃預變性5 min,94℃變性 1 min,63℃退火 1 min,72℃延伸 2 min,共 30個循環;72℃延伸 10 min。取適量 PCR擴增產物,在 2%瓊脂糖凝膠電泳(80V,25min),溴化乙啶(EB)染色,紫外燈下觀察結果并拍照。用凝膠成像分析儀進行半定量分析,以檢測基因β-actin的相對亮度表示該基因 mRNA的相對表達量。

表1 Nucleotide sequences of the Annexin-1靶向siRNA的序列

1.2.5 Western印跡檢測轉染前后膀胱癌T24細胞 Annexin-1蛋白的表達 取狀態良好對數生長期細胞 5×106個,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 2遍,于冰上加冷的細胞裂解液,制備細胞總蛋白,Lowry法蛋白定量。將樣品置于 5×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠加樣緩沖液中,100℃加熱 10 min使蛋白質變性,聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白免疫法(Western)印記,按 0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量稀釋的抗體,于搖床上室溫 2 h,PBS漂洗濾膜3次,加入辣根過氧化物酶標記二抗,將漂洗過的硝酸纖維素膜移至上述底物溶液中,輕輕搖動,蛋白條帶的顏色達到要求,即用水沖洗,濾紙吸干,拍攝膜的照片,結果保存。內參對照使用小鼠抗人 β-actin(稀釋度為 1∶10 000),以保證上樣量一致。

1.2.6 siRNA和脂質體的細胞毒性檢測 細胞用無血清和無抗生素的培養液洗滌重懸,每孔 2×104加入 96孔板。分別加入用 Opti-MEMⅠ稀釋的 siRNA(終濃度為 100 nmol/L)或 Lipofectamine2000(終濃度為 2 ml/L),6 h后加入含 20%血清的培養液補足血清,72h后分別加入5 mg/ml的噻唑藍(MTT),每孔20μl,37℃置 4h,棄上清,每孔加入 100μl二甲基亞砜(DMSO),待完全溶解后,測定其在 570nm的吸光度,并計算細胞存活率。對照孔細胞中加入等量的 Opti-MEMⅠ代替脂質體或SiRNA,其余培養條件與處理組相同。

1.2.7 MTT法檢測細胞對順鉑敏感性的變化 取對數生長期的細胞,用含有 10%血清的RMPI1640培養液調整細胞濃度為1×105/ml,接種于 96孔培養板中,每孔 180μl,在 37℃,5%CO2條件下培養 24h。分組加藥,每個濃度設3個平行孔,處理組加不同濃度的順鉑,陰性對照組加等體積的生理鹽水,使每孔終體積為 200μl,培養 68 h后,每孔加入 5 mg/ml的 MTT 20μl,37℃繼續培養 4h,2 000 r/min離心 10min,棄上清,每孔加入 100μl DMSO,振蕩至沉淀完全溶解,在酶標儀上檢測570nm光密度(OD)值。按以下公式計算腫瘤細胞生長抑制率。以同一藥物的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量反應曲線,求出該藥物的半數抑制濃度IC50,即細胞存活率減少 50%時的藥物劑量。

1.3 統計學處理 應用 SPSS11.0軟件進行統計分析,數據以x±s表示,兩組均數間比較采用 t檢驗,多組均數間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1mRNA表達的影響經 AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)軟件分析,以 40nmol/L濃度轉染 T24細胞 24 h后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組 mRNA表達水平明顯降低,在 24h下調(80.63±0.24)%,(t=474.3,P=0.001);在48 h下調(38.9±0.85)%,(t=64.833,P=0.01),72 h恢復正常。見圖 1。

2.2 siRNA對膀胱癌 T24細胞Annexin-1蛋白表達的影響與隨機對照的 siRNA相比,靶向Annexin-1的 siRNA轉染后細胞內Annexin-1蛋白表達明顯下降,并且與 RT-PCR結果一致。見圖 2。

2.3 siRNA轉染后膀胱癌 T24細胞對順鉑敏感性的變化MTT法顯示,以 40nmol/L濃度轉染 T24細胞 24 h后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組細胞對順鉑的 IC50值(μg/ml)均有不同程度的下降,從30.27下降到 7.81、6.94和 5.75,順鉑敏感性顯著增加(P＜0.05)。同時以不同濃度順鉑培養后細胞生存率亦明顯下降,與對照組比較差異顯著(P＜0.05),見圖 3。

2.4 siRNA和脂質體的細胞毒性檢測結果 T24細胞經靶向Annexin-1基因的 siRNA或 oligolipofectamine處理后計算細胞存活率,與未處理的 T24細胞相比,沒有顯著統計學差異,顯示siRNA及脂質體本身在實驗條件下對細胞基本沒有毒性作用。

圖1 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1mRNA表達的影響

圖2 siRNA對膀胱癌 T24細胞 Annexin-1蛋白表達的影響

圖3 不同濃度順鉑培養后T 24細胞生存率變化

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統中最常見的腫瘤之一,在美國其發病率居全身各部位腫瘤的第四位,在我國則排至第八位,近年來發病率呈上升趨勢〔3〕。目前,就 Annexin-1的表達缺失是否與膀胱癌細胞的異常增殖潛力相關以及對化療藥物的敏感性尚未明了。

RNA干擾是由雙鏈 RNA分子在mRNA水平關閉相應序列基因表達使其沉默的過程,是一種典型的轉錄后基因調控方法,此時啟動子是活躍的,靶基因能夠被轉錄,但不能正常累積mRNA。其優點首先表現在 siRNA只引起與其同源的mRNA降解,而其他基因的表達不受影響,因此具有高度的序列專一性。實驗證實,導入細胞的 siRNA只能引起同源基因表達的抑制,而無關基因不受影響〔4〕。在 siRNA序列中配對的 19～21nt中如果只改變一個核苷酸,就可以使該 siRNA序列不對靶 mRNA起作用,證明RNA干擾有明顯的特異性。其次RNA干擾是通過自身放大機制來發揮作用,極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表達,因此與反義寡核苷酸等基因封閉技術相比,具有高效性〔5〕。另外 RNA干擾操作簡便快捷,利用RNA干擾技術,甚至可以在 1 w之內關閉 10個基因。

Elbashir等〔6〕首次報道 siRNA在哺乳動物體外培養細胞中能夠成功的誘導特異基因受阻。作為一種有效抑制基因表達的方法,RNA干擾技術在近幾年被廣泛用于基因的功能研究。雙鏈 siRNA的合成是進行 RNAi研究的關鍵〔7〕,本研究中采取了體外轉錄法,即在噬菌體RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下,以連有噬菌體啟動子的線性DNA為模板,直接合成出特異雙鏈siRNA。RNA聚合酶是體外轉錄合成 siRNA的關鍵酶,除了在本實驗中用到的 T7 RNA聚合酶,其他通用的 RNA聚合酶還有 T3、SP6 RNA聚合酶,它們均是以 DNA為模板的RNA聚合酶。DNA模板必須連有特異的啟動子序列,啟動子區域是噬菌體 RNA聚合酶結合和 RNA開始合成的部位,因此本實驗在設計寡核苷酸模板的時候,3′端均加上T7啟動子引物 5′CCTGTCTC3′。在 RNA聚合酶結合到雙鏈 DNA啟動子后,聚合酶分開雙鏈 DNA模板,并以 3′～5′鏈作為模板合成出互補的5′～3′RNA鏈,合成出的正反義 RNA鏈經雜交即可得雙鏈RNA。在本研究中,以 AA開頭針對 597 bp的 Annexin-1 cds區的靶序列共有 26個,其中 GC堿基含量在 50%以下的有 25個,對其進行 Blast分析,最終選擇了 240～260(SⅠ),435～455(SⅡ)和 506～526(SⅢ)的 3段序列,其中 SⅠ siRNA靶序列的GC含量為 43.9%,SⅡ siRNA靶序列的 GC含量為 39.2%,SⅢsiRNA靶序列的 GC含量為 41.2%。結果表明 3段 siRNA序列都有抑制 Annexin-1基因表達的作用,但是SⅡ siRNA抑制作用要更強一些。通過研究 3對不同的靶向干擾序列和1對陰性對照序列,發現在mRNA水平 3對靶向序列均可抑制 Annexin-1的表達,在蛋白水平也獲得較高的抑制效果。

本研究還提示轉染 T24細胞后 siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組細胞對順鉑的 IC50值(μg/ml)分別下降了 3.8、4.4和 5.3倍,順鉑敏感性顯著增加。通過干擾 Annexin-1基因,可以改變膀胱癌 T24細胞生存能力,對照組在不同的順鉑濃度下(20～80μg/ml)生存率分別為 94.54%、87.22%、58.39%和 42.83%,經 3個 siRNA干擾后生存率明顯下降。膀胱癌 T24細胞是順鉑耐藥的細胞〔8〕,siRNA干擾后對順鉑敏感性增加,從而為順鉑耐藥的治療提供了一個很好的思路。

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5 Pal-Bhadra M,Bhadra U,Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell,2002;9(2):315-27.

6 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interfernce in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411(6836):494-8.

7 Berezhna SY,Supekova L,Supek F,et al.siRNA in human cells selectively localizes to target RNA sites〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA,2006;103(20):7682-7.

8 Konstantakou EG,Voutsinas GE,Karkoulis PK,et al.Human bladder cancer cells undergo cisplatin-induced apoptosis that is associated with p53-dependent and p 53-independent responses〔J〕.Int JOncol,2009;35(2):401-16.