雌激素對紫外線作用下人永生化角質形成細胞的保護作用

仇金鵬 李 澄 任 明 胡玉琳 佟 倜 王艷姝

(吉林大學第一醫院麻醉科,吉林 長春 130021)

接觸過多的紫外線可以使人類的皮膚癌、白內障等疾病的發病率升高。紫外線可以通過損傷皮膚細胞DNA,誘發自由基和細胞因子/炎癥趨化因子的產生,產生脂質過氧化損傷對皮膚造成光損傷導致皮膚衰老甚至引發皮膚癌〔1～3〕。雌激素作為一種甾體類激素,可以通過影響皮膚厚度、濕度、彈性、血管供應、色素沉著來阻止皮膚老化,在抗皮膚衰老方面,有其獨到之處〔4,5〕,有研究表明雌激素可以抑制氧自由基(ROS)產生,減少氧化應激,具有一定的抗氧化和抗凋亡作用〔6〕,然而對于雌激素對人角質形成細胞(HaCaT細胞)是否具有保護作用,通過什么途徑進行保護還知之甚少。因此,本實驗預先用雌二醇(17β-E2)處理 HaCaT細胞來觀察其對中波紫外線(UVB)照射導致細胞損傷的影響,探討雌激素的作用機制,為研究皮膚光老化發生中 17β-E2的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 RPMI1640培養基、胰蛋白酶(Gibco,美國)、臺盼藍(Amresco,美國)、MDA試劑盒(南京建成)、DMSO(Sigma,北京鼎國分裝,美國)、FAC Scan流式細胞儀(Bection Dickinson FACScalibur,美國)、生物顯微鏡(CH型,OLYMPUS,日本)、UVB燈(15W,上海顧村光電儀器廠)、Fluo-3/AM(Biotium,美國)、羅丹明 123(Sigma,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HaCaT細胞在 37℃、5%CO2條件下培養于含 10%標準胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基中。當細胞融合至 85% ～90%時傳代,棄掉培養液,PBS沖洗 2遍,用 0.25%胰酶常規消化,用含血清的培養液迅速終止消化,制成單細胞懸液。細胞計數,按 1×105接種于 100mm培養皿中備用。

1.2.2 分組及處理 當培養皿內細胞融合達 60%左右時,將細胞隨機分為正常組、UVB組、17β-E2組。棄掉舊培養液,用高壓滅菌的 PBS沖洗 3遍后,正常組和 UVB組加入含 1%FBS的 10ml RPMI1640培養液,17β-E2組加入 5μl 0.2 mmol/L雌激素 +含 1%FBS的 10 ml RPMI1640培養液,放培養箱中繼續培養 24h后棄掉舊的培養液,用高壓滅菌的 PBS沖洗 3遍,向每個平皿內加入 4 ml PBS,使之能浸沒整個平皿底。UVB組和17β-E2組打開平皿蓋在 15 W的 UVB燈正下方照射 6 min,正常組細胞用錫紙蓋住。照射后,立即棄掉平皿內PBS,加入4ml 4℃預冷的 PBS沖洗 3遍。之后加入 RPMI1640培養液于培養箱繼續培養 12h后收獲各組細胞備用。

1.2.3 細胞內鈣離子 ([Ca2+]i)濃度測定 將各組細胞常規消化后制成單細胞懸液,用 PBS調整細胞計數至 106個 /ml。取含有 5×105個細胞的懸液至 1.5 ml微量離心管中;向微量離心管中加入 Fluo-3/AM Ester(終濃度 5μmol/L),混勻;在37℃孵箱中避光反應 45 min后用 PBS洗滌 2次(1 500 r/min,5 min);在流式細胞儀(FCM)檢測,檢測條件為激發波長488nm、發射波長 530 nm。

1.2.4 細胞線粒體膜電位(△Ψm)測定 各組細胞消化后制成單細胞懸液,用PBS調整細胞計數至 106個/ml。取含有 5×105個細胞的上述細胞懸液至 1.5 ml微量離心管中;向微量離心管中加入 Rh123(終濃度5 mg/L),混勻;在 37℃孵箱中避光反應 45 min后 PBS洗滌細胞 2次(1 500r/min,5 min);在流式細胞儀(FCM)檢測,檢測條件為激發波長488nm、發射波長530nm。

1.2.5 總超氧化物歧化酶(SOD)測定 細胞中 SOD能清除超氧陰離子自由基(),保護細胞免受損傷。受 UVB照射后的細胞超氧陰離子自由基增高,細胞中 SOD對自由基進行清除從而含量減少。可氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑作用下呈紫紅色,用可見光分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含有 SOD時,則對有專一性抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少,比色時測定管的吸光度值低于對照管吸光度,通過公式可以計算出被測樣品中的SOD活力。

1.2.6 丙二醛(MDA)含量測定 采用硫代巴比妥酸反應比色法。

1.3 統計學處理 采用 SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結 果

2.1 17β-E2對紫外線作用下 HaCaT細胞△Ψm和[Ca2+]i濃度的影響 與正常組比較,UVB組和 17β-E2組的△Ψm均顯著下降(P＜0.05);17β-E2組的△Ψm顯著高于 UVB(P＜0.05)。正常組的[Ca2+]i顯著低于 UVB照射組和 17β-E2組(P＜0.05);17β-E2組細胞的[Ca2+]i與 UVB組相比較,差異不顯著(P＞0.05)。見表 1。

表1 17β-E2對紫外線作用下 HaCaT細胞△Ψm和[Ca2+]i濃度的影響(n=3,x±s)

2.2 各組細胞MDA含量及SOD活性檢測結果 與正常組細胞比較,17β-E2組和 UVB照射組細胞 MDA含量均顯著升高(P＜0.05),SOD活性顯著下降(P＜0.05);與 UVB組細胞相比較,17β-E2組細胞 MDA含量顯著下降(P＜0.05),SOD活性顯著升高(P＜0.05)(見表 2)。

表2 17β-E2對紫外線作用下 HaCaT細胞氧化損傷的影響(n=3,x±s)

3 討 論

引起皮膚損傷的紫外線主要是長波紫外線(UVA)和UVB,而UVB對皮膚的損傷程度要比 UVA大 1 000倍。UVB的波長為 280～320 nm,隨著波長的增加,UVB對皮膚的穿透深度可達 0.01～10 mm,可作用的組織從表皮淺層到表皮深層,甚至真皮層〔7,8〕。UVB可通過輻射產生自由基,造成皮膚組織氧化損傷,被認為是最主要的致癌紫外線波段〔9〕。雌激素是一種甾體類激素,主要來源于卵巢和腎上腺皮質,主要包括17β-E2、雌酮及其代謝產生的雌三醇等,其中 17β-E2作用最強。雌激素在抗皮膚老化、加速皮膚損傷修復、促進毛發生長及抑制皮脂腺分泌等方面均發揮重要作用〔6〕。研究表明,雌激素也是一種損傷修復調節因子,在人類和動物模型中,可以逆轉年齡相關的損傷愈合,局部或系統應用雌激素能減輕炎癥反應,減少炎癥因子的產生,明顯提高機體的免疫反應,促進傷口愈合〔10～12〕。雌激素不僅對年齡相關的皮膚老化起作用,對其他的物理因素(如光損傷)引起的老化也有明顯的修復作用,能夠通過保護血管內皮抑制動脈粥樣硬化形成,還能中和氧自由基從而抑制脂質過氧化過程〔6〕。本研究結果說明雌激素能夠提高△Ψm,降低[Ca2+]i濃度,維持線粒體的氧化磷酸化,減少內源性自由基的產生,同時降低細胞內由于照射產生的脂質過氧化產物 MDA的含量,從而抑制脂質過氧化作用,減輕UVB對細胞的損傷,拮抗紫外線所致的皮膚損傷作用,對皮膚細胞起到一定的保護作用。

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