熒光法測定醛糖還原酶活性的優化

王俊杰 方會龍 段小毛 肖和平 谷 娟 李 玲 歐陽冬生

(中南大學臨床藥理研究所,湖南 長沙 410003)

醛糖還原酶(Aldose Reductase,AR)是葡萄糖代謝多元醇通路的限速酶,高血糖可激活AR,使葡萄糖經多元醇通路的代謝增強,造成山梨醇在細胞內的蓄積和還原劑如還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的缺失,導致細胞膜的結構和功能受損而干擾細胞的正常代謝。動物和臨床實驗均提示,高血糖激活AR是糖尿病并發癥的主要發病機制之一〔1〕。最新研究發現 AR還在心肌缺血〔2〕及內毒素引起的休克反應〔3〕中發揮著重要作用。因此,測定紅細胞AR活性,對研究AR與相關疾病發病機制的關系具有重要意義。目前測定 AR活性有熒光法和比色法。紅細胞 AR活性測定多采用熒光法〔4〕,其原理為 NADP與強堿作用產生熒光信號,其強度與NADP的濃度成正比,咪唑可保護熒光的穩定性,當定量且過量的 NADPH存在時,以 DL-甘油醛為底物,可通過測定NADP的生成或NADPH的減少來反映 AR活性。新近有研究顯示 NADP生成法靈敏度和重復性更好〔5〕,為此,我們對該方法進行了優化。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性 10周齡 SD大鼠 20只,由中南大學動物實驗中心提供,隨機分成 2組:對照組和糖尿病組。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 NADPH(純度 ＞98%,ROTH公司),NADP(純度 ＞90%,ROTH公司),DL-甘油醛(Wako公司),鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司),其他試劑均為國產分析純。熒光分光光度計(日本產島津 RF-5000),京都血糖儀(日本第一科學株式會社)。

1.2.2 大鼠糖尿病模型的復制 大鼠適應性喂養 3 d,禁食12 h,糖尿病組按 5.5 ml/kg體重單次腹腔注射 STZ溶液 (STZ用 0.1 mol/L pH 4.2的檸檬酸緩沖液配成 10 mg/ml的溶液),3 d后尾靜脈采血隨機測血糖≥13.5 mmol/L者為糖尿病大鼠,對照組注射等量檸檬酸緩沖液。飼養期間所有大鼠自由飲水進食。4 w后眼眶采血,血糖儀測定血糖。

1.2.3 制備裂解紅細胞 4 w后,眼眶采血,取肝素抗凝血1 ml,3 000 r/min×10 min分離紅細胞,然后加 4倍體積 4℃預冷的生理鹽水,3 000r/min×10 min×3次離心洗滌紅細胞,按照50μl/支分裝 (一支實驗管,其余備用),-20℃凍存。取凍存紅細胞加 200μl 10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0),振蕩溶解10 min,3 000r/min×10 min,去沉淀。

1.2.4 AR活性測定反應體系 每份樣品一式三份,冰上操作,反應體系(終濃度):135 mmol/L PBS,100 mmol/L硫酸銨,0.04 mmol/L DL-甘油醛,150 μmol/L NADPH,5 μl紅細胞溶血液,總體積 200μl。實驗管加上述所有試劑,空白管以去離子水代替 NADPH。加入 DL-甘油醛后立即 37℃水浴反應。

1.2.5 終止反應 5 min后,將樣本同時放入冰浴中,加入600μl 0.5mol/L HCl后 60℃水浴 15 min來終止反應并破壞反應剩余的 NADPH。冰浴冷卻后加入 250μl 6%高氯酸3 000 r/min×10 min離心沉淀血紅蛋白,吸取上清 1 ml,-20℃凍存。

1.2.6 熒光值測定 加入 2 ml 6 mol/L NaOH(內含10 mmol/L咪唑)37℃水浴 5 min激發 NADP產生熒光,Ex 360nm/Em460 nm測定熒光強度。

1.2.7 血紅蛋白含量測定〔6〕用高鐵氰化血紅蛋白法。實驗管加稀釋液 3 ml,紅細胞溶血液 12μl,空白管以去離子水代替紅細胞溶血液,混勻,靜置 5 min,以空白管調零測實驗管在540nm的吸光度值,計算血紅蛋白含量 Hb(g/L)=OD540×367.7。每份樣品平行做三份取均值。

1.2.8 繪制標準曲線并計算 AR活性 反應體系與條件同上,去離子水代替紅細胞溶血液,NADP(0～1 000μmol/L)代替 NADPH,以NADP濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標做標準曲線,求回歸方程。由方程求得 NADP生成量,以每分鐘產生1μmol NADP為 1個酶活性單位(U),計算 AR活性。

1.2.9 血紅蛋白對AR活性測量值的影響 ①按照以上實驗方法分別測定在加入 2.5、4、5、6、10μl同一紅細胞溶血液的情況下激發的熒光強度;②在終止反應后的NADP溶液中未加入250μl 6%高氯酸沉淀血紅蛋白,然后測定激發的熒光強度。

1.2.10 樣本的保存周期 以同一溶血液為標本,測定反應體系生成的 NADP溶液在 -20℃凍存 0、4、24 h,1、2、4 w后的NADP激發的熒光強度。

1.2.11 同一紅細胞溶血液激發熒光的水浴反應時間對熒光強度的影響 ①37℃水浴 5 min后測量 NADP產生的熒光值;②37℃水浴 30 min后測量 NADP產生的熒光值;③37℃水浴60 min后測量 NADP產生的熒光值。

1.3 統計學分析 實驗結果用x±s表示,兩樣本均數比較用t檢驗,多樣本均數比較(成組設計)用單因素方差分析。統計分析采用 SPSS12.0統計軟件包。

2 結 果

2.1 標準曲線與回歸方程 NADP標準曲線的回歸方程:熒光強度 =2.828+1.419×NADP濃度,則 NADP濃度 =(熒光強度-2.828)/1.419。

2.2 血紅蛋白對AR活性測量值的影響 在未去除血紅蛋白的條件下,紅細胞溶血液在 2.5～10μl的范圍,熒光強度隨紅細胞血紅蛋白量的增加而降低;在終止反應后的 NADP溶液中加入 250μl 6%高氯酸沉淀血紅蛋白,熒光強度隨紅細胞溶血液的含量升高而升高,提示紅細胞對熒光測量值有較大干擾。紅細胞溶血液 2.5、4、5、6、10μl各組未去除血紅蛋白測定的熒光值均低于去除血紅蛋白測定的熒光值(P＜0.05),見表 1。

表1 紅細胞溶血液在去除和未去除血紅蛋白條件下激發的熒光強度(x±s)

2.3 樣本的保存周期 -20℃凍存 4、24 h,1、2、4 w后的NADP溶液測定的熒光強度分別是:45.2±1.7,44.2±1.3,45.4±1.9,44.1±2.1,44.4±2.3與對照組(44.9±1.2)比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.4 激發熒光的水浴反應時間對熒光強度的影響 生成的NADP溶液加入含咪唑的 NaOH后,在 37℃水浴分別放置 5、30、60 min激發熒光值,各組間總體均數差異均有統計學意義(P＜0.05),各組間變異系數的差異無統計學意義(P＞0.05),見表 2。

表2 激發熒光的不同水浴時間測量的熒光強度(x±s)

2.5 各組大鼠血糖和紅細胞AR活性比較 糖尿病大鼠造模4 w后血糖為(22.72±3.42)mmol/L與對照組血糖(6.25±1.04)mmol/L比較顯著升高(P＜0.05)。糖尿病大鼠 AR活性(5.64±2.28)U/mg較對照組(1.45±0.98)U/mg顯著升高(P＜0.05)。

3 討 論

紅細胞 AR活性測定常采用熒光法,本實驗中采用的是NADP生成熒光法,其測定步驟為:一定時間內的反應,終止反應,激發熒光并測定熒光值,根據標準曲線、熒光值和蛋白含量計算 AR活性。體外測定AR活性的原理是,AR使底物DL-甘油醛轉化為 DL-甘油酸的同時,NADPH被氧化成 NADP,NADP可進一步與強堿作用產生熒光,熒光強度與其濃度成正比,加入咪唑可以在一定時間內防止熒光強度衰減。因此通過測定NADP生成可以反映AR的活性。

本研究結果顯示,紅細胞溶血液在 2.5～10μl范圍內,未去除血紅蛋白測定的熒光值均低于去除血紅蛋白測定的熒光值,且隨著紅細胞溶血液的濃度增大,熒光值的差異也越大,提示血紅蛋白對熒光值影響較大,推測可能是由于血紅蛋白上的亞鐵離子與 NADP發生氧化還原反應而減弱了熒光。終止反應后用 6%高氯酸沉淀血紅蛋白可以避免熒光值的消減。

反應體系生成的 NADP溶液是否能長期保存目前未見報道,我們的研究結果發現,NADP溶液經過 4、24 h、1、2、4 w的貯存時間后激發熒光強度無統計學差異。建議實驗可以分段進行,以提高效率,特別適合需要在別處使用熒光分光光度計的實驗室。

目前測定紅細胞 AR活性的方法中,激發熒光的水浴反應時間主要有 5、30、60min。結果顯示,37℃水浴 5min熒光強度已接近最大值,5～60 min激發的熒光值逐漸增大。5～30 min比 30～60 min AR活性變化的趨勢緩和,60 min的標準差高于5和 30 min,但變異系數的差異無統計學意義。但為提高實驗效率,建議采用 37℃水浴 5 min的實驗方案。

AR活性是通過 AR催化底物DL-甘油醛反應 5 min后輔酶的改變來計算的。加入底物DL-甘油醛開始計時,37℃水浴5 min加入HCl終止反應后停止計時。由于一次有多個樣本需要終止反應。因此建議樣本在 37℃水浴進行反應后,樣本同時置于冰浴中再加入 HCl終止反應,可減小實驗誤差。

由于實驗條件和方案的不一致,AR活性測量值會有差異,用優化后AR活性測定的NADP生成法能夠準確反映糖尿病大鼠紅細胞 AR活性的變化。

1 Yabe-Nishimura C.Aldose reductase in glucose toxicity:a potential target for the prevention of diabetes complications〔J〕.Pharmacol Rev,1998;50(1):21-33.

2 Kariserova K,Srivastava S,Hoetker JD.Redox activation of aldose reductase in the ischemic heart〔J〕.J Biol Chem,2006;281(22):15110-20.

3 Ramana KV,Willis MS,White MD,et al.Endotoxin-induced cardiomyopathy and systemic inflammation in mice is prevented by aldose reductase inhibition〔J〕.Circulation,2006;114(17):1838-46.

4 劉長山.糖尿病者紅細胞醛糖還原酶測定的方法學探討〔J〕.遼寧實用糖尿病雜志,2001;9(4):23-5.

5 張志華,葉 玲,劉建偉,等.熒光法動態觀察糖尿病大鼠紅細胞醛糖還原酶活性〔J〕.中國老年學雜志,2005;25(4):426-8.

6 葛榮正,李洪東,李秀蘭,等.氰化高鐵法測定血紅蛋白應注意的幾個問題〔J〕.中國衛生檢驗雜志,2001;11(4):105.