氟伐他汀對誘導分化的 HL-60細胞 VEGFmRNA表達的抑制作用

趙麗艷 林 海 石 艷 苗春生 李蘊潛

(吉林大學第二醫院檢驗科,吉林 長春 130041)

腫瘤血管生成能力增強不僅導致腫瘤細胞數量迅速增加,而且增加了腫瘤轉移的危險性。腫瘤細胞能產生多種血管生長因子,其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是與血管生成關系最密切的生長因子,VEGF不僅對實體瘤的發生發展產生明顯影響,而且在多數造血系統惡性腫瘤中也起重要作用〔1〕,抑制 VEGF表達或活性已成為造血系統惡性腫瘤治療的新策略〔2,3〕。以往研究表明,氟伐他汀(fluvastatin,Flu)能抑制 HL-60人早幼粒細胞白血病細胞(HL-60細胞)增殖并誘導凋亡〔4〕,但 Flu對誘導分化的 HL-60細胞 VEGF mRNA表達的影響尚未見報道。本研究著重探討Flu對誘導分化的 HL-60細胞血管內皮生長因子 VEGF mRNA表達的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-60細胞(中國醫學科學院天津血液研究所),RPMI 1640培養基(Gibco公司),小牛血清(Hycolon公司),Flu(北京諾華制藥有限公司),全反式維甲酸(ATRA),甲羥戊酸(mevalonate,Mev),硝基四氮唑藍(NBT),牛血清白蛋白、二甲基亞砜(DMSO)、佛波酯(Sigma公司),VEGF及 β-actin引物(上海生工生物技術公司合成)。

1.2 細胞培養 HL-60細胞在含 10%小牛血清、100 U/ml青霉素和 100μg/ml鏈霉素的 RPMI 1640培養液中,37℃、5%CO2培養箱飽和濕度下培養。

1.3 細胞的處理 收集對數生長期細胞,用含 10%小牛血清的 RPMI 1640培養液配成 105/ml濃度的細胞懸液,接種于培養瓶中,隨機分為空白對照組、陽性對照組、Flu處理組和Flu+Mev處理組。Flu處理組和 Flu+Mev處理組加入終濃度為20μmol/L的 Flu,Flu+Mev處理組在加入 Flu的同時加入終濃度 Mev 100μmol/L,陽性對照組加入終濃度 ATRA 10μmol/L,空白對照組加入等體積DMSO,作用 72h后收獲細胞。

1.4 NBT還原能力測定 各組經不同處理的HL-60細胞接種于 24孔板處理 72 h后,每孔加入含 1.25mg/ml NBT、17 mg/ml牛血清白蛋白及 2μg/ml佛波酯的 PBS溶液,37℃溫育 2 h。離心棄上清液,加入 3 ml DMSO溶解結晶物,用 721型分光光度計測 580 nm處吸光度(A),以 A值大小表示細胞NBT還原能力。NBT還原能力測定是判斷細胞分化的標志物和敏感指標,在一定波長下其吸光度值越大細胞的還原能力越強,而未分化的白血病細胞則缺乏這種還原能力,故吸光度值低。

1.5 VEGF mRNA表達的檢測 取經不同處理的 HL-60細胞,按Trizol試劑盒說明書操作方法提取總RNA。用紫外分光光度計在 260 nm和 280 nm處測 A值,OD260/OD280在 1.8～2.0,根據A260值計算 RNA濃度。按逆轉錄試劑盒操作說明將 RNA逆轉錄成cDNA,以 cDNA為模板,分別用VEGF和 βactin的引物進行 PCR擴增。VEGF上游引物:5′-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3′, 下 游 引 物:5′-CCTGGTGAGAGATCTGGT TC-3′,擴增產物為 516、588和 648 bp。 β-actin上游引物:5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′, 下 游 引 物:5′-AAAGAAAGGGTGTAAAA CGCA-3′,擴增產物為 432 bp。取 PCR產物進行 2%瓊脂糖凝膠(含 0.5μg/ml溴化乙錠),3 V/cm電泳30～50 min,紫外燈下照相,用凝膠成像處理系統對每一樣品PCR產物擴增的特異性片斷(VEGF和β-actin)進行灰度掃描,以 β-actin密度作為參考定量標準,數值以兩者之積分吸光度的比值表示,以對照組的比值作為標準 1.0。

1.6 統計學方法 數據以 x±s表示,顯著性檢驗采用 SPSS 11.0軟件,組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 NBT還原能力 用 Flu處理 HL-60細胞 72 h后,其 NBT還原能力(0.63±0.09)較對照組(0.22±0.06)顯著升高(P＜0.01),接近陽性對照組(0.76±0.16)的水平。 Flu+Mev處理組 HL-60細胞 NBT還原能力(0.34±0.04)與 Flu處理組比較明顯降低(P＜0.01)。表明 Flu可誘導 HL-60細胞分化,而Mev能夠逆轉 Flu的誘導分化作用。

2.2 VEGFmRNA表達 HL-60細胞經 ATRA和 Flu處理 72 h后,VEGFmRNA表達水平(分別為 1.51±0.02和 1.58±0.04)均較陰性對照組(1.87±0.05)明顯下調(P＜0.01)。Flu+Mev處理組 VEGF mRNA表達的下調(1.76±0.06),與 Flu處理組比較具有統計學意義(P＜0.05)(圖 1)。

圖1 氟伐他汀處理對 HL-60細胞 VEGF mRNA表達

3 討 論

近年研究表明,某些惡性腫瘤細胞在誘導劑的作用下,可以重新分化為正常或接近正常的細胞,即腫瘤細胞的誘導分化,這種療法已成為腫瘤治療的新方向。本研究中,用 Flu處理 HL-60細胞 72 h后,其 NBT還原能力較對照組顯著升高,接近陽性對照組的水平,表明 Flu已誘導 HL-60細胞發生了分化。用 Flu和 Mev共同處理后 HL-60細胞 NBT還原能力又明顯降低,提示Mev可以逆轉 Flu的誘導細胞分化作用。

研究發現,惡性血液病細胞VEGF呈高表達,并不同程度表達 VEGF受體〔1〕。抑制 VEGF生物學作用可能會直接抑制血液腫瘤的生長和存活〔5〕,并將抗血管治療概念從實體瘤引入血液腫瘤研究中,這是近年對抗血管生成治療白血病認識的進一步深化。本研究顯示,HL-60細胞經 Flu處理 72 h后VEGF mRNA表達水平明顯降低,表明Flu能抑制已分化的 HL-60細胞 VEGF基因表達。

目前有關研究顯示,微摩爾濃度的他汀類藥物能降低VEGF合成〔6〕。Araujo等觀察到阿托伐他汀能通過下調 VEGF表達而抑制炎性血管生成〔7〕,但尚不清楚Flu通過何種機制引起 VEGF基因表達下調。本研究發現,HL-60細胞用 Flu和Mev共同處理后,可以逆轉由 Flu誘導 VEGF mRNA表達的下調,即可使已下調的VEGF mRNA表達水平又增加到接近于空白對照組的水平,提示 Flu下調 VEGF基因表達的作用可能是通過“甲羥戊酸途徑”介導的。Hata等〔8〕用視網膜內皮細胞研究辛伐他汀的抗血管生成作用時也證實,抑制甲羥戊酸依賴途徑是 Flu這一作用的可能機制。甲羥戊酸是 HMG-CoA還原酶反應的重要產物,他汀類藥物能抑制甲羥戊酸及其下游產物的生成,阻斷蛋白質翻譯后的異戊二烯化加工,干擾小 G蛋白Ras介導的細胞內信號傳導,從而影響細胞的生物學功能〔9,10〕。

有研究表明〔10〕,除了降低膽固醇作用外,他汀類在體內體外都顯示出抗白血病作用,Flu與其他抗腫瘤藥物合用,可增強腫瘤細胞對放療的敏感性,增強ATRA對急性早幼粒細胞白血病細胞誘導的分化,逆轉 ATRA抗白血病作用的抗藥性,減少化療藥物的用量及毒副作用,提示 Flu具有多方面有益作用,在急性粒細胞白血病的治療中可能具有良好的應用前景。

1 Zini JM,Tobelem G.Angiogenesis and hematologic malignancy〔J〕.Bull Cancer,2007;94(Suppl):S241-6.

2 Kessler T,Fehrmann F,Bieker R,et al.Vascular endothelial growth factor and its receptor as drug targets in hematological malignancies〔J〕.Curr Drug Targets,2007;8(2):257-68.

3 Li WW,Hutnik M,Gehr G.Antiangiogenesisin haematological malignancies〔J〕.Br JHaematol,2008;143(5):622-31.

4 趙麗艷,石 艷,王忠山,等.氟伐他汀對人早幼粒白血病 HL-60細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.吉林大學學報 (醫學版),2008;34(2):254-7.

5 Dias S,Choy M,Alitalo K,et al.Vascular endothelial growth factor(VEGF)-C signaling through FLT-4(VEGFR-3)mediates leukemic cell proliferation,survival,and resistance to chemotherapy〔J〕.Blood,2002;99(6):2179-84.

6 Dulak J,Józkowicz A.Anti-angiogenic and anti-inflammatory effects of statins:relevance to anti-cancer therapy〔J〕.Curr Cancer Drug Targets,2005;5(8):579-94.

7 Araujo FA,Rocha MA,Mendes JB,et al.Atorvastatin inhibits inflammatory angiogenesis in mice through down regulation of VEGF,TNF-alpha and TGF-beta1〔J〕.Biomed Pharmacother,2010;64(1):29-34.

8 Hata Y,Miura M,Asato R,et al.Antiangiogenic mechanisms of simvastatin in retinal endothelial cells〔J〕.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2010;248(5):667-73.

9 Hindler K,Cleeland CS,Rivera E,et al.Therole of statins in cancer therapy〔J〕.Oncologist,2006;11(3):306-15.

10 Buhaescu I,Izzedine H.Mevalonate pathway:a review of clinical and therapeutical implications〔J〕.Clin Biochem,2007;40(9-10):575-84.