板栗毛殼水提液對大鼠腦缺血再灌注后過氧化氫酶和單胺氧化酶的影響

周麗霞 黃宏妙 李 靈 羅佩卓 梁曉艷 黃 煥

(廣西中醫學院藥學院,廣西 南寧 530001)

板栗毛殼是殼斗科植物板栗(castanea mollissima blume)的總苞。據《中華本草》記載,板栗毛殼具健脾益氣、補腎強筋、清熱散結、止血之功效,治療丹毒、腫毒等疾病〔1〕。板栗殼含有黃酮類、微量元素、多糖、氨基酸等多種化學成分〔2〕,板栗殼及板栗毛殼的水煎液、醇溶物、乙酸乙酯提取物還具有極強的抗菌、消炎作用和抗凝血、升高白細胞等生物活性〔3,4〕,而且低毒〔5〕。板栗殼色素具一定的抗氧化作用〔6〕,但其毛殼的抗氧化、抗衰老作用迄今未見有報道。本研究將通過觀察板栗毛殼水提液在大鼠腦缺血再灌注損傷后對過氧化氫酶(CAT)、單胺氧化酶(MAO)的影響,初步研究其抗氧化、抗衰老的作用,使其藥用價值得到有效開發。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 雙縮脲試劑盒、MAO測定試劑盒、CAT測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品;板栗毛殼采集于廣西隆安縣那桐鄉那重村,經廣西中醫學院藥用植物學教研室劉壽養教授鑒定為殼斗科植物板栗(Castanea mollissima Blume)的總苞。

1.1.2 動物 健康 SD大白鼠 48只,雌雄各半,體重(200±20)g,由廣西中醫學院實驗動物中心提供。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計 UV-160(日本 shimadzu公司);1411高頻小電刀(上海醫療器械高技術公司);江彎-Ⅰ型 C通用立體定向器(第二軍醫大學);TGL-16型臺式高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);FSH-Ⅱ高速電動勻漿器(江蘇省金壇市醫療儀器);WXH微型旋渦混合器(上海躍進醫療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1 板栗毛殼水提液的制備 將洗凈干燥后的板栗毛殼粉碎,稱取干燥粉末 100 g,用 8倍量純凈水浸泡 1 h,加熱煮沸30 min,濾出水煎液,繼續分別加 6倍量純凈水再煮 2次,合并水煎液,濃縮至 100ml(相當于 1 g生藥/ml)。

1.2.2 動物分組 將 48只SD大鼠隨機分為 4組:無藥無手術組(空白對照組)、無藥手術組、給藥手術組、給藥無手術組。給藥組:每天按 10 ml/kg鼠,用板栗毛殼水提液灌胃。無藥組:每天灌服等量生理鹽水。灌胃 14d后進行實驗。

1.2.3 腦缺血再灌注模型的建立 采用四血管阻斷法〔7〕,即將麻醉大鼠定位頭顱,電凝阻斷左右椎動脈;再仰臥定位,掛線結扎雙側頸總動脈 15min,灌注 3 h后斷頭處死。

1.2.4 組織勻漿的制備 處死大鼠后,速取其腦、肝、腎、心,用 4℃生理鹽水洗凈,吸干,準確稱重,加入 9倍量生理鹽水,冰冷條件下以 3 000 r/min制成10%的勻漿。在 4～6℃條件下高速低溫離心 20min,取上清液,置冰箱 4℃保存備用。

1.2.5 蛋白質、CAT、MAO含量的測定 參照蛋白定量(雙縮脲法)、CAT、MAO測試盒說明書。

1.2.6 統計方法及軟件 數據用x±s表示,采用組間 t檢驗,用中國醫學百科統計軟件包(PEMS V2.1)進行統計分析。

2 結 果

2.1 板栗毛殼水提液對大鼠腦、肝、腎、心中CAT活性的影響見表 1。

2.2 蛋白定量測定結果 見表 1。各組大鼠各組織蛋白量均比較接近,各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 板栗毛殼水提液對大鼠心、腦、肝、腎中MAO活性的影響見表 1。

表1 板栗毛殼水提液對大鼠器官組織勻漿 CAT、蛋白含量、M AO活力的影響(x±s,n=6)

3 討 論

蛋白定量測定主要是為了求出各組織勻漿蛋白濃度,給CAT和 MAO含量的計算提供數據。由表 2數據可知,與無藥無手術組(空白對照組)比較,無藥手術組的 CAT活力明顯降低(P＜0.01),表明腦缺血再灌注損傷后能顯著降低大鼠腦、肝、腎、心組織的 CAT活力;而給藥手術組或給藥無手術組均比無藥手術組的 CAT活力明顯升高(P＜0.01或 P＜0.05),表明喂食板栗毛殼水提液后,大鼠機體組織的CAT活力顯著增強。由表 3數據可知,與無藥無手術組(空白對照組)相比,無藥手術組各組織勻漿的 MAO活力顯著增高(P＜0.05),提示腦缺血再灌注損傷后使自由基增加而增強了 MAO的活性。而給藥手術組或給藥無手術組均能顯著降低MAO的活性,與無藥手術組相比有顯著差異性(P＜0.01或P＜0.05),表明板栗毛殼水提液對大鼠組織勻漿的MAO活力有抑制作用。

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血致腦細胞損傷,恢復血液再灌注后,其缺血性損傷反而進一步加重的現象〔8〕。腦缺血再灌注引起腦組織損害的病理機制包括自由基產生、細胞內鈣超載、能量耗竭、免疫介質產生、谷氨酸鹽釋放、離子穩態破壞、酸中毒、凋亡通路激活等。其中,自由基連鎖反應是腦缺血再灌注損傷的核心環節,而鈣超載則可能是導致神經元死亡的最后通路〔9〕。自由基的過量產生或抗氧化物酶的活性降低都可引起不同程度的細胞毒性及瞬時不可逆損失。因此,只有及時治療,促進體內抗氧化物酶活性的增強,清除氧自由基、抑制脂質過氧化反應,才能消除炎癥、減輕組織缺血再灌注造成的損傷。

CAT的測定結果提示,在腦缺血再灌注損傷后,大鼠腦、肝、腎、心組織中,具有清除自由基作用的 CAT活性減弱,會導致自由基大量產生而對組織造成損傷。而給予板栗毛殼水提液灌胃后,可提高大鼠腦、肝、腎、心組織中 CAT的活性,增強機體抗氧化能力,從而減輕腦缺血再灌注造成的損傷。

MAO的測定結果提示,在腦缺血再灌注損傷后,大鼠腦、肝、腎、心組織可能由于大量自由基的產生增強了 MAO的活性。MAO活性上升會引起中樞兒茶酚胺水平下降造成生化損害。MAO活性增高,是導致急性腦缺血早期腦內去甲腎上腺素(NE)濃度下降,以致出現卒中癥狀的一個重要原因〔10〕。而給予板栗毛殼水提液灌胃后,能有效抑制 MAO的活性,以減少神經元的損害,達到延緩衰老的效果。

板栗毛殼水提液能提高 CAT活性,顯著降低 MAO活性。其醇溶性物質是否也具同樣作用?其降低神經元壞死的程度、減少腦缺血再灌注損傷后的卒中癥狀,還有待于進一步研究。本研究希望能為藥材的功效、進一步的開發利用提供一定的科學依據。

1 國家中藥管理局 .中華本草〔M〕.上海:上海科學技術出版社,1999:2422.

2 趙德義,高文海,花成文,等 .板栗殼化學成分的初步研究〔J〕.陜西林業科技,2003;(2):43-7.

3 吳龍云,凌桂生,許學健,等 .板栗毛殼的抗菌活性成分〔J〕.中草藥,1991;22(8):370.

4 吳龍云,凌桂生,許振朝 .板栗殼浸膏抗菌抗炎作用及對胃腸平滑肌運動的影響〔J〕.廣西中醫藥,2002;25(4):54.

5 李愛媛,貝偉劍,趙 一,等 .板栗毛殼長期毒性的實驗研究〔J〕.湖南中醫藥導報,1996;2(4):31.

6 何玲玲,王 新,石中亮,等 .水提板栗殼色素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用〔J〕.食品與機械,2006;6:56-57.

7 劉亞君,崔 鶴,謝東萍,等 .Bcl2和 Bax在缺血預處理保護海馬神經元缺血再灌損傷中的作用〔J〕.山東大學學報(醫學版),2006;44(3):227-30.

8 韓 敏,劉艷凱,薛 茜 .腦缺血再灌注損傷的研究進展〔J〕.河北北方學院學報(醫學版),2006;23(10):75-8.

9 Cristina T,Rosaria G,Dechun W,et al.Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats a time course study〔J〕.Eur J Pharmacol,2003;464(2-3):159-62.

10 許世凱.抗衰老藥物學〔M〕.北京:中國醫藥科技出版社,1994:158.