紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結構和細胞凋亡及bcl-2、bax蛋白表達的影響

徐傳金 張文忠 馮培青 蔡尚郎

(青島大學醫學院附屬醫院心內科,山東 青島 266003)

紅花黃色素(safflower yellow,SY)是從紅花中提取的有效成分〔1,2〕,是臨床常用的活血化瘀藥物?，F代藥理研究表明,紅花水煎劑能抑制血小板聚集,降低血液黏稠度〔3〕,其有效成分SY能延長凝血酶原時間和凝血酶時間〔4〕。SY具有提高心肌和血漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,加速自由基的清除等作用〔5〕。本實驗通過觀察 SY對家兔缺血再灌注心肌超微結構和凋亡及相關基因表達的影響,驗證其對心肌缺血的保護作用,并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 健康新西蘭大白兔 24只(購自河南醫科大學動物中心),雌雄不分,體重 2.0～2.5 kg,隨機分為 3組,每組 8只。缺血再灌注組(IR組):結扎左冠狀動脈前降支1 h,再灌注 6 h。SY組:于再灌注前 10 min耳緣靜脈注射 SY 10 mg/kg,余同 IR組。藥物組(MI組):于再灌注前 5min耳緣靜脈注射磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制劑 LY 294002(0.3 mg/kg),余同 SY組。

1.2 方法

1.2.1 心肌缺血再灌注模型制備 采用烏拉坦(1 g/kg)耳緣靜脈注射麻醉。仰臥位固定,心電圖導線與兔四肢相連,記錄12導聯心電圖,連接心電監護。除毛,沿胸骨正中偏左 0.5 cm切開皮膚,暴露左側 3、4肋骨,鈍性分離肋間肌,小彎鉗于肋下穿 10號縫合線 2根,分別結扎,沿結扎線正中剪斷 3、4根肋軟骨;牽拉兩側結扎線,暴露胸腔,分離脂肪組織,可見心包及搏動之心臟。提起心包膜正中,用眼科剪將心包膜前部剪開,將心包膜用縫線固定于胸壁,充分暴露心臟。用止血鉗將左心耳輕輕提起,觀察冠脈的走行。以左冠狀動脈主干為標志,在左心耳根部下方 2 mm處,用持針器持小圓針在冠狀動脈前降支根部穿一結扎線,結扎線穿過心肌表層,在肺動脈圓錐旁穿出;在該結扎線下方約 0.5 cm處再穿一結扎線,雙重結扎左前降支1 h,再灌注 6 h。心電圖胸前導聯出現ST段弓背向上抬高為結扎成功。

1.2.2 心肌細胞光鏡學觀察 各組動物于再灌注末取缺血壞死區心肌組織行蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察心肌細胞形態學改變。實驗步驟如下:取材→固定→脫水和透明→透蠟→包埋→切片及貼附→脫蠟復水→染色→水洗→分化→漂洗→復染→透明→封藏,切片經中性樹膠封藏,等樹膠干后就可在鏡下進行觀察。

1.2.3 心肌細胞電鏡學觀察 各組動物于再灌注末取缺血壞死區心肌組織進行超薄切片觀察心肌細胞超微結構改變。實驗步驟如下:①取材:取缺血再灌注區組織,制成 1 mm3的組織塊;②2.5%戊二醛 4℃固定 4 h;③磷酸緩沖液(PBS)漂洗 3次;④1%鋨酸固定 3 h;⑤PBS漂洗 3次;⑥脫水;⑦浸透:用二甲基酮與 Epon812包埋劑混合液(1∶2)浸透;⑧包埋:將樣品移到 Epon812包埋劑中進行包埋;⑨超薄切片:用 UltracutE超薄切片機進行超薄切片,厚度為 50～100 nm,干燥后即可染色;⑩染色:醋酸雙氧鈾染色 15 min,蒸餾水徹底水洗 3次;枸櫞酸鉛染色 15min,再用蒸餾水徹底水洗 3次。切片干燥后即可置于電子顯微鏡(日本JEOL公司JEM-1200EX透射電鏡)下觀察。1.2.4 原位末端標記凋亡細胞末端轉移酶標記技術(Tunel法)檢測 嚴格按照試劑盒說明書操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞,即凋亡細胞。每張切片隨機選擇 5個視野(×400),記錄陽性染色的心肌細胞數及心肌細胞總數,以凋亡細胞數占心肌細胞總數的百分比來確定凋亡指數(AI)。AI=Tunel陽性細胞數/心肌細胞總數 ×100%。

1.2.5 心肌細胞中 bcl-2、bax蛋白表達的免疫組化(SP)法檢測 將取材中 10%中性甲醛固定的標本固定 24h后行常規石蠟包埋、切片,厚度約 4.5μm,貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。①二甲苯和酒精脫蠟;②3%過氧化氫孵育 10 min以消除內源性過氧化物酶活性,PBS液沖洗;③5%～10%正常山羊血清封閉,室溫孵育 10 min;④加入一抗:bcl-2、bax均為 1∶100稀釋后加入玻片中,4℃過夜,PBS液洗 3次,每次 5 min;⑤加入二抗:滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗,37℃孵育 30 min,PBS洗 3次,每次 5min。⑥顯色:加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑 5～10 min;⑦HE復染 2 min,脫水、透明、封片、鏡檢。每張切片隨機選取 5個視野(×400)采用 VIDAS圖像分析系統(德國歐波同公司)測定其陽性表達面積、平均光密度和積分光密度,并采用公式:單位面積平均光密度 =〔積分光密度/(512×512)〕×100%進行數據換算。

1.3 統計學處理 實驗數據均以 x±s表示,使用 SPSS12.0統計學軟件進行分析,組內比較采用方差分析,兩組間比較采用 q檢驗(Student Newman-Keuls法)。

2 結 果

2.1 光鏡學觀察 IR組心肌細胞間質水腫,細胞界限不清,可見較多粒細胞灶狀浸潤,并可見少量紅細胞滲漏。SY組心肌細胞輕度水腫,界限清楚,心肌細胞排列相對規則,見少量粒細胞浸潤,無紅細胞滲漏。MI組心肌細胞水腫嚴重,部分細胞溶解,細胞界限欠清楚,橫紋消失,可見較多粒細胞浸潤,并可見紅細胞滲漏。

2.2 電鏡下觀察 IR組心肌細胞水腫明顯;線粒體明顯腫脹,溢出到細胞外,嵴明顯減少,基質中致密顆粒減少甚至消失,伴空泡樣形成;肌膜破壞,出現膜斷裂、缺損,肌原纖維模糊,部分 Z線不明顯;細胞核腫脹,異染色質增多,核不規則,甚至核碎裂。SY組超微結構變化輕微,僅見心肌細胞內輕度水腫;線粒體輕度腫脹,嵴部分消失;肌原纖維排列規則,肌小節清楚,僅見少量肌絲斷裂,Z線明顯,閏盤清晰;細胞核內物質分布均勻,無核裂解及固縮現象。MI組細胞水腫明顯,胞膜固縮消失;線粒體彌漫性腫脹,;糖原減少,肌原纖維極度松弛、拉長,Z線扭曲、變形,肌絲橫斷、撕裂、溶解;核固縮,可見凋亡小體;間質明顯水腫。

2.3 凋亡細胞 Tunel檢測結果 IR組AI為 21.37±3.86,SY組 AI明顯降低(15.47±3.63)(P＜0.01),而 MI組 AI(23.38±3.77)與 IR組接近(P＞0.05)。

2.4 心肌細胞中 bcl-2、bax蛋白的表達 bcl-2陽性細胞表現為胞漿及胞膜呈棕褐色,bax陽性細胞表現為胞漿呈棕褐色。著深棕色者為強陽性表達細胞,不著色者為陰性表達細胞,介于兩者之間者為弱陽性表達細胞。各組心肌細胞bcl-2、bax蛋白表達見表 1。

表1 各組心肌細胞 AI、bcl-2、bax蛋白表達(x±s,%)

3 討 論

心肌細胞超微結構的改變是反映細胞損傷最直觀的指標,心肌缺血 30～40 min,心肌細胞可發生缺血性損害。光鏡下觀察見正常心肌細胞內中性粒細胞及紅細胞浸潤等損傷。線粒體對缺血缺氧十分敏感,是決定細胞由可逆到不可逆改變的關鍵細胞器,線粒體彌漫性腫脹,膜破裂、嵴溶解、消失,基質出現嗜鋨性顆粒等均是缺血造成的損傷。本研究發現,SY可以減輕心肌細胞超微結構的變化,從而對心肌產生保護作用。

細胞凋亡是機體的正常細胞在受到生理性或病理性刺激后啟動的自發死亡過程是缺血再灌注損傷發病機制中的一個重要環節〔6〕。大多數細胞在凋亡過程中需要新基因的表達和蛋白質的合成。bcl-2基因是凋亡抑制基因,其過量表達可阻斷因缺血、細胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、c-myc等不同刺激誘發的細胞凋亡。bcl-2抑制凋亡的機制是它可直接或間接地阻止細胞色素 C自線粒體的釋出,而后者可與 ATP一起改變Apaf-1的構型而使caspase-9激活。bax基因為促進凋亡基因,主要表達于線粒體膜和內質網膜上。bax與 bcl-2有很高的同源性,能與 bcl-2形成異源二聚體,通過抑制后者的活性,使凋亡易于發生。bcl-2和 bax的表達程度決定了細胞命運,bcl-2占優勢時阻止細胞凋亡發生,而 Bax占優勢時細胞趨向凋亡〔7〕。本研究采用 Tunel法、SP技術檢測了心肌細胞 AI及bcl-2、bax蛋白的表達,結果顯示各組均有一定的心肌細胞凋亡,而 SY組 AI明顯較低,證實了 SY可以減輕缺血再灌注損傷后的心肌細胞凋亡程度;同時發現SY組 bcl-2蛋白表達增強,而 bax蛋白表達明顯減少,進一步顯示,SY對缺血再灌注心肌凋亡相關基因的表達具有顯著的作用,即明顯上調 bcl-2的表達、下調bax的表達,從而發揮對心肌的靶保護作用。

目前認為缺血預處理的機制是短暫的缺血再灌注使大量的內源性物質如腺苷、緩激肽、阿片等釋放〔7〕,然后作用于相應的受體,誘導蛋白激酶C(PKC)的激活,再進一步激活其他激酶,最終激活再灌注損傷補救酶(RISK)途徑,使效應器磷酸化,效應器可能主要是線粒體上的 ATP敏感性鉀通道(mKATP),誘導心肌保護機制〔8〕。 PI3K是 RISK信號轉導通路的組成之一〔9〕。本研究通過應用藥物 PI3K抑制劑 LY294002發現,該藥物能夠阻斷 SY對心臟的保護作用,因此推測RISK參與了 SY對心肌的保護作用,其具體機制尚待進一步研究。

1 李中原,涂秀華.紅花黃色素的藥理研究進展〔J〕.中藥新藥與臨床藥理,2005;16(2):153-6.

2 李 芳,孫明智.紅花黃色素對豚鼠心室乳頭肌缺氧和復氧損傷的保護作用〔J〕.哈爾濱醫科大學學報,1999;33(1):6-8.

3 顧紅璋.中藥紅花煎劑對血小板聚集功能的影響〔J〕.中國血液流變學雜志,1994;2:48.

4 黃正良,崔程梅,任 遠.紅花黃色素的抗凝血作用研究〔J〕.中成藥,1987;18(4):22.

5 劉月慶,李 康,畢開順.紅花黃色素 A在大鼠體內的藥動學研究〔J〕.中草藥,2003;34(8):725-7.

6 吳 青,陶紅凱,陶大昌,等.缺血再灌注誘導心肌細胞凋亡及凋亡相關基因表達的研究〔J〕.中國心血管病研究雜志,2004;2(11):905-8.

7 孫忠東,高尚志,池一凡,等.腎缺血預處理對兔未成熟心肌 Bcl-2,Bax,Fas蛋白表達的影響〔J〕.第四軍醫大學學報,2005;26(22):2039-41.

8 Philipp S,Yang XM,Cui L,et al.Postconditioning protects rabbit hearts through a protein kinase C-adenosine A(2b)receptor cascade〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2):308-14.

9 Tsang A,Hausenloy DJ,Mocanu MM,et al.Postconditioning:a form of“modified reperfusion”protects the myocardium by activating the phosphatidylinosito-kinase-Akt pathway〔J〕.Circ Res,2004;95(3):230-2.