丙泊酚對大鼠肺缺血再灌注損傷細胞凋亡及相關蛋白的影響

付笑飛 趙 松 劉東雷 王建軍 (華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院,湖北 武漢 430022)

在肺缺血再灌注損傷(lung ischemia reperfusion injury,LIRI)的過程中細胞凋亡是導致肺組織損傷的重要原因之一〔1〕。丙泊酚(propofol)是臨床常用的靜脈麻醉藥,已有研究表明其對 LIRI有一定的保護作用〔2〕,但其機制尚不完全清楚。本研究通過建立大鼠在體 LIRI模型,觀察丙泊酚對 LIRI肺細胞凋亡及相關蛋白的影響,并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料及實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠 42只,體重250～300 g(同濟醫學院動物飼養中心提供)。主要試劑:鼠抗Bcl-2、Bax抗體(Santa Cruz公司,美國)、原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑(Roche公司,德國)、二步法免疫組化檢測試劑(PV-6001)(北京中杉金橋生物科技有限公司)。主要藥物:丙泊酚注射液(Astra Zeneca公司,意大利)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 實驗動物隨機分為 3組,每組14只,分別為:假手術組(S組),除不作缺血處理外,余同其他組;肺缺血再灌注組(IR組),缺血 1 h,再灌 3 h;丙泊酚組(P組),缺血前 30 min靜脈輸注丙泊酚 5 mg/kg?h-1,缺血 1 h,再灌 3 h。IR組和P組每組又分為兩個亞組,再灌時間分別為1、3 h,每個亞組 7只大鼠。

實驗前 4h禁食,腹腔注射4%戊巴比妥 50mg/kg麻醉后,仰臥位固定。行頸部氣管切開、插管,并游離右側頸靜脈和頸動脈。接動物呼吸機行機械通氣維持呼吸,右側經靜脈插管、固定,接微量注射泵;然后左側第 5肋間開胸,鈍、銳性結合游離左肺門。靜息 5 min后,于呼氣末用無創血管夾阻斷左左主支氣管、左肺動脈和左肺靜脈。阻斷 1 h后開放,進行再灌注1、3 h。于 1、3h實驗結束時結扎肺門取出左肺待用。

1.2.2 肺組織Bcl-2、Bax蛋白檢測 采用二步免疫組織化學法(PV)法檢測 Bcl-2、Bax蛋白的表達情況。各組標本用 10%甲醛固定,石蠟包埋切片,嚴格按照免疫組織化學試劑盒進行操作,陽性標準為細胞質染色呈棕色,陰性對照組用 PBS代替一抗。在顯微鏡下觀察,每張切片隨機選取 5個視野,使用MIAS-2000圖像分析系統分析陽性區域平均光密度值(OD),以OD值大小代表陽性產物表達的多少。

1.2.3 原位細胞凋亡檢測 用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。光鏡下觀察細胞核染為棕黃色為凋亡細胞。每例標本的切片隨機選取 5個高倍鏡視野(40×10),按凋亡指數(AI)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%計算。

1.2.4 肺組織病理學檢測 4%多聚甲醛固定 24h,常規石蠟包埋、切片、HE染色,光鏡下(×200)進行觀察。

1.3 統計學處理 數據均采用 SPSS13.0軟件分析,數據以x±s表示,組間比較采用 t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1 肺組織 Bcl-2、Bax蛋白表達及 Bcl-2/Bax比值變化 與 S組相比,IR組、P組肺組織 Bcl-2、Bax蛋白含量均明顯增加(P＜0.05);與 IR組相比,P組 Bcl-2蛋白表達明顯增加,Bax表達減少(P＜0.05),見表 1。

表1 再灌注后不同時相Bcl-2、Bax蛋白(OD值)及 Bcl-2/Bax比值變化(x±s)

2.2 肺細胞凋亡指數(AI)變化 與 S組相比,IR組、P組肺AI值均明顯增加(P＜0.05);與IR組相比,P組各時相 AI值減少,差異有統計學意義(P＜0.05)。IR組、P組各組內各時相均以再灌注 3h時 AI值最高,見表 2。

表2 再灌注后不同時相肺細胞AI值變化(x±s)

2.3 肺組織病理學檢查 光鏡下觀察 HE染色病理切片,S組肺組織結構完好,肺泡腔完整,無明顯滲出。水腫及炎性細胞浸潤;IR組肺泡壁明顯增厚,肺泡腔縮窄,可見大量炎癥細胞浸潤;P組肺組織病理改變較IR組輕,表現為肺泡壁輕度水腫及增厚,肺泡內可見中性粒細胞浸潤。

3 討 論

LIRI可發生于多種臨床情況,是肺移植早期和心肺轉流術后肺功能障礙的重要原因之一,而在LIRI發生過程中,由于細胞內活性氧增加、鈣穩態失調及持續的低 pH等多種誘因,導致肺泡上皮細胞凋亡從而使肺功能受損。研究表明,Bcl-2和Bax是細胞凋亡相關基因中的重要成員,Bcl-2是主要的抑凋亡基因,它主要通過阻止線粒體內細胞色素 C的釋放、抑制 caspase-3激活來阻止細胞凋亡〔3〕;Bax是 Bcl-2的同源體,其作用是通過抑制 Bcl-2來促進細胞凋亡〔4〕,Bcl-2/Bax的比例關系與細胞凋亡的調控密切相關〔5〕。本研究中觀察到 IR組、P組肺細胞AI值與 S組相比明顯增加(P＜0.05),證實了細胞凋亡在LIRI中起到重要作用。與 IR組相比,P組可明顯增強肺組織 Bcl-2蛋白的表達,降低Bax蛋白的表達,使 Bcl-2/Bax比值增加而細胞凋亡指數降低,說明丙泊酚可能是通過調節Bcl-2/Bax途徑來抑制 LIRI。

丙泊酚是一種新型的酚類靜脈麻醉藥,其化學成分為 2,6-二異丙基酚,大量研究顯示其對缺血再灌注損傷有一定的保護作用,這種作用可能與其清除自由基的抗氧化作用有關〔6〕。本研究中病理切片觀察到給予丙泊酚后肺組織水腫及炎性滲出較IR組明顯減輕,說明丙泊酚可以通過減輕肺水腫起到對肺組織缺血再灌注損傷的保護作用,這與徐詠梅等〔2〕的研究結論相一致。此外丙泊酚還可以通過調節細胞內鈣離子平衡起到抗凋亡的作用〔7〕。

1 Cobelens PM,Putte BP,Kavelaars A,et al.Inflammatory consequences of lung ischemia-reperfusion injury and low-pressure ventilation〔J〕.J Surg Res,2009;153(2):295-301.

2 徐詠梅,薄玉龍,呂湘琪,等 .丙泊酚對大鼠肺缺血-再灌注損傷的影響〔J〕.臨床麻醉學雜志,2007;23(9):756-8.

3 Park SE,Park C,Kim SH,et al.Korean red ginseng extract induces apoptosis and decreases telomerase activity in human leukemia cells〔J〕.J Ethnopharmacol,2009;121(2):304-12.

4 Garcia EJ,Lawson D,Cotsonis G,et al.Hepatocellular carcinoma and markers of apoptosis(Bcl-2,Bax,Bcl-x):prognostic significance〔J〕.Applied Immunohistochem Mol Morphol,2002;10(3):210-7.

5 Huang YC,Chuang LY,Hung WC.Mechanisms underlying nonsteroidal anti-inflammatory drug-induced p 27(Kip1)expression〔J〕.Mol Pharmacol,2002;62(6):1515-21.

6 Chen L,Gong Q,Xiao C.Effectsof propofol,midazolam and thiopental sodium on outcome and amino acids accumulation in focal cerebral ischemia-reperfusion in rats〔J〕.Chin Med J,2003;116(2):292-6.

7 曹江北,李云峰,米衛東,等 .丙泊酚對細胞內鈣離子的調節〔J〕.國外醫學?藥學分冊,2002;19(5):293-6.