衰老對大鼠腰骶髓排尿相關核團 5-羥色胺轉運體表達的影響

樊 平 康云霄 石葛明 王 磊 張國梁 李 錦

(河北醫科大學神經生物研究室,河北 石家莊 050017)

研究顯示,老年人多有排尿障礙,隨著衰老而出現尿頻、尿不盡等癥狀〔1〕,老年大鼠也有類似的排尿障礙〔2〕,這可能與排尿的神經調節或排尿器官的衰老性改變有關。脊髓參與排尿控制的傳出核團位于腰骶膨大處,這些排尿相關核團接受許多下行纖維的支配,其中 5-羥色胺(5-HT)能神經纖維的信息傳遞在排尿控制中起著十分重要的作用〔3～6〕。腰骶髓排尿相關核團 5-HT能神經體系是否隨衰老出現表達降低尚不清楚。本研究利用免疫組織化學方法分析老年大鼠腰骶髓排尿相關核團 5-HT神經體系特異性標記物 5-羥色胺轉運體(serotonin transporter,SERT)免疫陽性纖維和膨體分布及反應強度的變化,探討老年排尿障礙的神經作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選取 3月齡和 24月齡健康雄性 Wistar大鼠 12只,由河北醫科大學實驗動物中心提供,每月齡組各 6只。

1.2 儀器與試劑 CM1850恒冷箱冷凍切片機(德國 Leica公司產品),HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(武漢長海科技有限責任公司產品);多克隆兔抗 SERT抗體購自美國 ImmunoStar公司,山羊抗兔生物素化二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶復合物購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學及圖像分析 所有大鼠于深麻醉下以 4%多聚甲醛常規經心灌注固定,取第 1、第 2腰髓節段(L1～L2)和第 6腰髓到第 1骶髓(L6～S1)節段后固定 4 h,加入 30%蔗糖溶液 4℃過夜。將所取部位橫斷面冷凍切片(40μm)、間斷集片,經PBS洗片后行 SABC免疫組織化學顯色。步驟:正常血清室溫孵育切片 30 min、1∶2 000多克隆 SERT抗體 4℃孵育48 h、1∶500生物素化二抗室溫孵育 2 h、1∶500鏈霉親和素-過氧化物酶復合物室溫孵育1 h、DAB顯色 5min;常規梯度脫水、透明、封片。陰性對照實驗以PBS替代一抗。切片以 HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統測量各月齡組大鼠灰質后連合(dorsal grey commissure,DGC)、中間外側核(intermediolateral nucleus,IML)、前角運動核(VH)、背外側核(dorsal lateral nucleus,DLN)、球海綿體肌脊髓核(spinal nucleus of the bulbocavernosus,SNB)和骶副交感核(sacral parasympathetic nucleus,SPN)SERT免疫反應強度的灰度值。

1.4 統計學方法 數據以x±s表示,經方差齊性檢驗后行成組設計的 t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠腰骶髓排尿相關核團SERT免疫組化 脊髓腰骶部排尿相關核團含有較豐富的 SERT免疫陽性纖維及膨體,點狀的免疫反應膨體分布于核團神經元胞體周圍。兩組大鼠核團SERT免疫陽性纖維和膨體的分布方式未見明顯區別,但免疫反應強度在兩組存在顯著差異,24月齡組 SERT免疫陽性纖維及膨體在 DGC、IML、VH、DLN和 SNB少于 3月齡組。見圖 1。

2.2 衰老對大鼠腰骶髓排尿相關核團SERT免疫反應強度的影響 與 3月齡組比較,24月齡組所觀察的部分核團SERT免疫反應陽性纖維和膨體的灰度值顯著增加;在 DGC升高了13.3%;IML、VH、DLN和 SNB分別升高了 10.7%、8.3%、12.4%和 5%。兩組 SPN處SERT免疫反應陽性纖維和膨體的灰度值無顯著差異,僅存在升高的趨勢。見表 1。

圖1 大鼠腰骶髓排尿相關核團SERT免疫組織化學顯色(×40)

表1 衰老對大鼠腰骶髓排尿相關核團SERT免疫反應強度的影響(x±s)

3 討 論

SERT是位于 5-HT能神經末梢的一種膜蛋白,從突觸間隙中重攝取 5-HT入突觸前末梢,從而調節 5-HT的作用強度和時間,其表達變化直接影響 5-HT能神經元參與的神經活動。研究表明,SERT比 5-HT更能準確反映腦內 5-HT能神經體系的變化〔7〕。本研究顯示,DGC、IML、VH、DLN和 SNB的 SERT免疫反應陽性纖維和膨體顯著減少,SPN處雖無顯著差異,但也存在降低趨勢。利用 SPECT/PET方法顯示老年人腦中縫背核SERT配基結合信號減少的結果〔8〕支持本研究結果。以往運用高效液相色譜分析法(HPLC)的研究雖未見腰骶髓 5-HT的年齡變化,但觀察到 5-HT代謝產物 5-HIAA(五羥吲哚乙酸)水平的改變〔9〕,與本研究觀察結果的差異很可能與用于 HPLC檢測的脊髓組織不僅含有灰質,還含有白質干擾了結果分析有關。

腰骶髓排尿相關核團在維持下尿路正常的儲存和排尿這兩個功能上起著十分重要的作用,大鼠脊髓的 SNB和DLN與人 Onuf核相似,兩核團的運動神經元發出纖維通過陰部神經支配尿道外括約肌或盆底肌群;腰 1～腰 2節段 IML、DGC的交感節前神經元以及 SPN的副交感節前神經元通過投射到相應的節后神經元而支配膀胱和尿道的平滑肌;而腰 5～骶 1節段DGC的部分中間神經元可能參與調控支配膀胱平滑肌的副交感節前神經元的活動〔10～12〕。老年大鼠腰骶髓這些核團 5-HT轉運體免疫反應陽性纖維和膨體的減少提示,5-HT能神經纖維對腰骶髓排尿相關核團神經元支配的減弱,這很可能與老年排尿障礙有關,但其詳細機制還有待進一步探究。

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