幾種支氣管沖洗液結核桿菌檢測方法對菌陰肺結核的診斷價值

肖海浩 湯春梅 周強 張言斌

肺結核確診的“金標準”是痰細菌學。菌陰肺結核定義為三次痰涂片及一次培養陰性的肺結核[1]。菌陰肺結核在臨床較多見，若其診斷缺乏“金標準”，易造成臨床誤診或漏診，通過支氣鏡檢查獲得細菌學依據的方法在臨床已廣泛開展。本文回顧性分析了2008年4月～2009年10月我院住院經支氣管鏡檢查的68例菌陰肺結核患者留取支氣管沖洗液采用涂片、培養、熒光定量PCR (fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)和噬菌體生物擴增法(phage amp lified biologically assay, PhaB)檢測結核分枝桿菌(m ycobacterium tubercu losis MTB)的結果，探討幾種方法對菌陰肺結核患者的臨床應用價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

68例初治菌陰肺結核患者均為2008年4月～2009年10月我院住院病人，其中男40例，女28例，年齡14～78歲,平均(38.9±10.5)歲。病程1d～3a不等。所有病人支氣管鏡檢查前痰涂片找抗酸桿菌≥3次陰性，1次培養陰性，臨床診斷為肺結核。

1.2 檢查方法

1.2.1 支氣管鏡方法

采用日本產Olym pusBF-260或Pentax EB-1530T3型電子支氣管鏡。按支氣管鏡檢查技術常規進行術前準備和局麻，支氣管鏡經鼻插入，通過聲門后依次檢查氣管和各級支氣管，仔細觀察各肺段支氣管黏膜情況。對鏡下可見病變者，于直視下在病變部位進行支氣管沖洗，將生理鹽水5～10m l注入相應的肺葉、肺段或亞段病變部位進行沖洗，再用吸引器將沖洗液收集入標本瓶中送檢，共2～3次。對鏡下病變不明顯者，則參照影像學所示的病灶位置，將支氣管鏡插入病灶位于的段或亞段支氣管開口處，按上述沖洗方法沖洗。

1.2.2 實驗室方法

對收集的支氣管沖洗液標本同時送檢以下4種檢測方法：⑴涂片找抗酸桿菌：按照中國防癆協會“結核病診斷實驗室檢驗規程”操作,用萋-尼氏染色抗酸染色法，≥3條抗酸桿菌/300視野為陽性。⑵結核菌培養：用BacT/A lert3D全自動分枝桿菌快速培養儀器系統(3D系統)進行臨床標本的分離培養。⑶應用熒光定量PCR(FQ-PCR)：檢測沖洗液結核分枝桿菌DNA，DNA基因拷貝數量＞1×103拷貝/m L為陽性。⑷噬菌體生物擴增法(PhaB)：采用英國BIOTEC公司結核桿菌檢測試劑盒(FAST Plaque T B M)，培養器皿中出現大小不等的噬菌斑，噬菌斑數≥20個或許多噬菌體斑互相融合成透明狀判定為陽性，器皿中無菌斑出現或噬菌斑數量＜20個為陰性。

1.2.3 統計學處理

采用SPSS10.0統計軟件包分析數據，用x2檢驗比較不同檢測方法診斷肺結核的陽性率，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

68例菌陰肺結核患者4種支氣管沖洗液檢測方法的結果：涂片、培養、熒光定量PCR和噬菌體生物擴增法陽性率分別為29.4%、54.4%、33.8%和14.7%，見表1。

表1 4種支氣管沖洗液檢測方法陽性結果比較

3 討論

痰菌陰性肺結核在我國達260萬之眾，大約占全部肺結核的40%～60%[2]。由于化療、免疫功能障礙，結核桿菌的某些生物學特性發生變異，痰菌含量少或呈L型結核菌、肺部病灶局限未與引流支氣管相通等因素，均可致使痰涂片檢查陰性。研究表明，菌陰肺結核并非沒有傳染性，只是在傳染的強度上低于痰菌檢查結果陽性的肺結核，因此，菌陰肺結核并非真正意義上的細菌學陰性[3]。支氣管鏡檢查作為一種幫助診斷肺結核的重要手段，可能獲得細菌學的依據，在臨床已廣泛開展。支氣管鏡檢查通過對支氣管、肺泡的機械性刺激,活檢鉗及毛刷損傷支氣管壁和病灶邊緣，之后進行沖洗可起到疏通引流支氣管，促進痰量增加的作用。將生理鹽水于病變部位注入遠端氣道及肺實質中，接觸病灶的范圍廣，進而負壓吸引收集沖洗液，回收量較多，含菌量相對多，深部的結核桿菌有可能被收集到沖洗液中，同時生理鹽水對支氣管的輕度刺激作用可誘發一部分病人出現不同程度的咳嗽，有利于深部結核桿菌排出，獲得結核分枝桿菌的機會增多[4]。因此支氣管沖洗液可能獲得較高的檢出率，與普通痰標本相比，能更好地反映疾病性質。

目前最基本的細菌學檢查方法——抗酸染色涂片，大多數人認為其敏感性低、特異性差，無法辨別死菌與活菌，無法判定是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌，對菌量較低的標本常易漏檢，陽性率低。但本組68例菌陰肺結核患者支氣管沖洗液涂片陽性率為29.4%，明顯高于噬菌體生物擴增法這種較新的檢測方法(P＜0.05)，與熒光定量PCR陽性率相當(P＞0.05)，表明對于菌陰肺結核的實驗室診斷，抗酸染色涂片仍具有較好的實用價值。作為支氣管沖洗液檢查的常規方法，該方法檢測速度快，經濟且簡單易行。

本組沖洗液培養結果陽性率為54.4%，反映出結核分枝桿菌培養這種傳統方法對于菌陰肺結核的支氣管沖洗液陽性檢出率，明顯高于涂片、熒光定量PCR和噬菌體生物擴增法(P＜0.05)。結核桿菌培養仍是目前診斷肺結核的金標準，尤其是進一步可行菌型鑒定和藥敏實驗，在指導臨床用藥及耐藥性監測等方面具有重要作用，這是其他方法無法比擬的。但缺點是耗時太長，難以達到臨床上需要快速檢測的目的，傳統的羅氏培養耗時約需6～8周，本院應用BacT/A lert3D全自動分枝桿菌培養系統(3D系統)使平均報告陽性時間縮短為19.30d，很大程度上改進了臨床診治的需求，但實驗費用較貴[5]。

由于結核菌生長緩慢，需要快速、靈敏和特異的病原學檢查和鑒定技術來幫助快速診斷菌陰肺結核。核酸探針和PCR為結核病細菌學基因診斷提供了可能。PCR是選用一對特定的寡核苷酸引物介導的結核菌某特定核酸序列的DNA體外擴增技術，它可以在短時間使特定的核酸序列拷貝數增加數百萬倍，在此基礎上進行探針雜交，提高了檢出的靈敏度和特異性。熒光定量PCR技術集PCR和DNA探針雜交技術的優點為一體，直接探測PCR過程中的熒光變化，獲得DNA模板的準確定量結果，可信性較高且技術簡單，操作快速，在結核早期快速診斷上具有臨床實用價值。有研究結果顯示痰液和支氣管肺泡灌洗液PCR檢測可獲得比涂片鏡檢明顯高的陽性率和略高于培養的陽性率，且省時快速[6-7]。缺點是由于其檢測方法靈敏度高，對標本的要求、實驗室配置、實驗室操作人員的操作的要求很高，容易出現假陽性的結果。本組68例患者應用熒光定量PCR檢測沖洗液結核分枝桿菌DNA陽性率33.8%，與沖洗液涂片的陽性率相當(P＞0.05)，優于噬菌體生物擴增法(P＜0.05)。我們認為沖洗液熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌DNA可做為快速診斷菌陰肺結核的一項病原學診斷參考檢測方法。

噬菌體生物擴增法(PhaB)是由W ilson等于1997年建立的一種結核分枝桿菌(MTB)快速檢測的新技術，近年來轉入臨床實驗室應用的研究正逐步開展。其檢測原理是：分枝桿菌噬菌體能感染活的MTB，未感染細菌的噬菌體則被隨后加入的殺毒劑所滅活，已進入感染菌體內的噬菌體不受影響。噬菌體在感染的菌體內大量增殖，并將菌體裂解，釋放出子代噬菌體。釋放出的噬菌體即可感染隨后加入的指示細胞(一種快速生長的分枝桿菌)，并將其裂解。指示細胞裂解后在瓊脂平板上出現透亮的噬菌斑。因此，根據噬菌斑的有無即可判斷待檢細菌是否為MTB，或待檢標本中是否存在活的MTB[8]。噬菌體在結核病快速診斷的研究報道很多，在臨床工作中針對痰結核分枝桿菌的檢測應用較多，多數研究認為噬菌體生物擴增法檢測結核分枝桿菌具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點，不需要特殊儀器設備、技術要求低，便于在臨床實驗室推廣應用。該方法通常24h即可獲得檢測結果，并且可以區別死菌或活菌，對及早診斷、及時治療以及療效觀察具有重要的參考價值[9-10]。但針對支氣管沖洗液結核分枝桿菌的檢測應用較少，本組68例患者支氣管沖洗液噬菌體生物擴增法檢查的陽性率僅14.7%，明顯低于傳統的涂片法、培養和熒光定量PCR(P＜0.05)，結果不令人滿意。分析其陽性率低的原因可能是該技術尚處于實驗研究階段,對臨床應用過程中支氣管沖洗液標本的留取和送檢規范尚不確定。同時陽性率低可能與部分標本中的結核分枝桿菌為死菌或部分標本中的含菌濃度低有一定關系[10]。另外許多人為因素可影響檢測結果，例如標本預處理、噬菌體濃度、感染時間、殺毒劑滅活條件、指示細胞的配制等[8]。因此，支氣管沖洗液噬菌體生物擴增法檢測對于菌陰肺結核的診斷價值有待進一步研究和探索。

綜上所述，支氣管沖洗液涂片和熒光定量PCR檢測對菌陰肺結核的快速診斷具有重要的臨床應用價值，噬菌體生物擴增法檢測對于菌陰肺結核的診斷價值有待進一步研究和探索，培養不僅是目前診斷肺結核的金標準，而且在這幾種檢測方法中陽性率最高。

[1]中華醫學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南[J].中華結核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74.

[2]肖和平.菌陰肺結核的診斷和治療[J].中國防癆雜志,2005,27(增刊):2-3.

[3]肖和平.菌陰肺結核在結核病控制中的重要性[J].中華結核和呼吸雜志,2005,28(10):665-666.

[4]常占平,彭勛,王洪芬,等.纖維支氣管鏡檢查對無痰或痰菌陰性不典型肺結核的診斷價值[J].中華臨床醫師雜志,2008,2(8):922-926.

[5]蔡杏珊,張院良,吳幸怡,等.BacT/Alert 3D系統與改良羅氏培養基分離培養分枝桿菌的效果比較[J].現代醫院,2008,8(10):57-58.

[6]唐林國,譚耀駒,何聚蓮,等.熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測痰結核分枝桿菌DNA及其臨床應用研究[J].醫學研究通訊,2005,(7):34-36.

[7]張紅漫,李志惠,田艷茹,等.熒光定量PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中結核菌DNA對肺結核診斷的臨床價值[J].河北醫藥,2008,30(10):1543-1544.

[8]胡忠義,倪蓮娣,靳安佳,等.噬菌體生物擴增法快速檢測結核分支桿茵方法學研究[J].中華結核和呼吸雜志,2004,27(12):801-805.

[9]靳安佳,王潔,胡忠義,等.噬菌體生物擴增法檢測肺結核患者痰標本臨床應用研究[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(8):807-808.

[10]甘兵,張天托,王棟,等.噬菌體生物擴增法與涂片法在快速檢測結核分支桿菌的應用比較[J].廣東醫學,2008,29(3):441-442.