藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠胰腺組織iNOS表達的影響

馬璇 劉琳 張蕊 劉吉東 沈衛

糖尿病與機體內自由基的增多以及抗氧化防御系統功能紊亂有關，氧化應激被認為是糖尿病各種并發癥的共同發病途徑[1]。藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種重要的色素蛋白，普遍存在于藍藻細胞中的光合輔助色素，由開鏈四吡咯化合物和脫輔蛋白通過硫鏈鍵結合，是螺旋藻(spiru lina)細胞中起重要光合作用的天然色素，在螺旋藻中的含量高達10%～20%[2]。研究表明，藻藍蛋白具有促進動物細胞的再生，清除自由基、抑制腫瘤、抗輻射、抗過敏、抗疲勞、抗病毒、增強免疫力和抗炎的作用[3]。目前，對藻藍蛋白的研究開發集中于抗腫瘤、神經保護作用等方面，針對糖尿病治療作用及其機制鮮有研究，本實驗利用2型糖尿病大鼠模型，觀察藻藍蛋白的抗氧化作用，探索其對2型糖尿病的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型

健康雄性W is t a r大鼠3 2只，鼠齡1個月，體重1 3 0 g～1 5 0 g，由青島市藥檢所實驗動物中心提供(SCXK(魯)20030010)。動物均于實驗前置于實驗室適應環境一周，自由飲食，室溫(23±2)℃，自然光照，相對濕度50%～70%。隨機分為正常對照組(8只)、模型組及藥物干預組(24只)。正常對照組大鼠喂以普通飼料，其余喂以高糖高脂飼料(15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、50%普通飼料)飼養[4-5]，四周后禁食12h，以30mg/kg劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液，正常對照組大鼠同步注射等量的檸檬酸緩沖液。注射1周后剪尾取血，測空腹血糖，以血糖值≥7.0mmol/L為糖尿病模型建立成功。24只大鼠造模成功，將其隨機分為模型組、藻藍蛋白組、二甲雙胍組各8只，其中模型組2只大鼠于實驗第11周死亡。

1.2 干預措施

糖尿病模型成功后(實驗第9周)開始干預治療。藻藍蛋白粉劑(藻藍蛋白由中國科學院海洋研究所提供)暗室分裝后-20℃保存，用前加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500m g/kg體重灌胃給藥(藻藍蛋白劑量由中國科學院海洋研究所推薦使用)，每天1次，連續10天；二甲雙胍組同步給予二甲雙胍(400m g/kg)，以蒸餾水稀釋至8%濃度連續灌胃10天。正常對照組和糖尿病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續灌胃10天。

1.3 血糖

各組動物分別在第1周末、第8周末、第10周末測空腹血糖(FBG)(mmol/L)。大鼠禁食12h后，次日早鼠尾靜脈取血，用血糖儀(強生醫療器材有限公司，穩豪型)測定空腹血糖。

1.4 免疫組化染色

治療結束后(11周初)，各組大鼠頸椎脫臼處死，迅速取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后10%甲醛固定24h，蒸餾水浸泡4h后。常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA 2135石蠟切片機連續切片，厚度5um，每隔20片取1片，每個標本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存備用。iNOS親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物司提供。取上述切片常規脫蠟至水，嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為片狀棕黃色粗顆粒。部分切片不加一抗以0.1mol/L PBS替代染色，不出現陽性著色。光學顯微鏡(400倍)下，每張切片隨機選擇4個視野，分別計數每個視野內100個胰島細胞中iNOS的陽性細胞數，以各組的陽性細胞數進行比較。

1.5 統計學處理

實驗數據以SPSS11.5統計軟件包處理，各組數據以均數±標準差(±s)表示；組間比較用方差分析，q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

造模成功后，糖尿病大鼠體重較正常組明顯降低(P＜0.05)。經過治療后，藻藍蛋白組和二甲雙胍組大鼠體重較模型組顯著增加(P＜0.05)，且兩組大鼠多飲、多食、多尿的情況有所改善，表明藻藍蛋白和二甲雙胍對糖尿病癥狀改善有一定的治療效果(表1)。

2.2 空腹血糖

STZ造模后，模型組、藻藍蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與正常組比較明顯升高(P＜0.05)。經干預治療后，藻藍蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

2.3 組織病理

正常組大鼠的胰島呈圓形或橢圓形的細胞團，胰島內細胞數量較多，細胞邊界清晰，排列整齊，分布均勻；糖尿病對照組大鼠的胰島內細胞數量明顯減少，細胞邊界不清，排列紊亂；部分細胞腫脹、皺縮、壞死、核缺失；藻藍蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細胞病變減輕，胰島細胞團形狀較規則，與模型組有較大改善，但與正常組相比仍有差距(圖1)。

2.4 iNOS表達

正常組大鼠胰島細胞iNOS呈弱表達，糖尿病模型組大鼠(2只死亡)胰島細胞iNOS表達較正常組增強(P＜0.05)，呈棕黃色，著色部位主要在胰島細胞胞漿。藻藍蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細胞iNOS表達較糖尿病組顯著降低(P＜0.05)，著色較淺，但藻藍蛋白組和二甲雙胍組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表3和圖2。

3 討論

Ceriello[6]等認為，氧化應激是胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同發病機制，機體因遭受各種有害刺激時，體內氧自由基產生過多；清除能力降低，當氧化系統和抗氧化系統失衡，就會導致機體組織和功能損傷[7-8]。NO是具有許多生物活性的自由基，是重要的信使分子和效應分子，但是其過量產生會發揮極強的細胞毒性作用。

在糖尿病早期，由于腎小球或視網膜內皮細胞產生NO增多，加上糖尿病患者普遍存在的脂毒性，非飽和游離脂肪酸上調誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)，產生過量的NO，過量的NO產生大量的過硝酸根離子(ONOO-)和OH-等自由基，損傷β細胞的結構和功能[9]。同時，增高的NO促進胰島素分泌，加之胰島素抵抗的加重及持續高血壓，刺激β細胞處于持續高分泌狀態，促進β細胞衰退，更加重了糖尿病的進展。另外，動物實驗發現，在所有組織中胰島內的具有抗氧化能力的超氧化物歧化酶(SOD)活性最低，胰島又是富含膜結構的組織，極易受自由基的攻擊，以上特性使胰島細胞受NO產生的氧化損傷作用增強。一氧化氮合酶(NOS)抑制劑可明顯降低BB大鼠糖尿病的發病率，進一步說明了NO在糖尿病中的重要作用。但是，由于NO半衰期極短，在組織中直接測定非常困難，Kolodziejska等[10]研究表明，在病理狀態下直接檢測組織中iNOS可客觀反映組織中NO的含量。

表1 各組動物體重的變化(±s)(單位：g)

表1 各組動物體重的變化(±s)(單位：g)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例數 1周 造模后(8周) 治療后(10周)正常組 8 145.25±5.01 347.88±21.50 390.38±28.54模型組 8 146.75±4.56 269.00±23.77 264.00±24.33△藻藍蛋白組 8 145.50±3.96 261.00±17.70 287.38±13.38△二甲雙胍組 8 148.38±3.46 260.13±26.24 288.25±21.99△

表2 各組大鼠空腹血糖的比較(±s)(單位：mmol/L)

表2 各組大鼠空腹血糖的比較(±s)(單位：mmol/L)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 例數 劑量(mg/kg) 造模后(8周) 治療后(10周)正常組 8 — 3.48±0.50 3.91±0.71模型組 8 — 9.15±3.20* 8.94±1.90*藻藍蛋白組 8 500 9.75±1.58* 7.05±0.87△二甲雙胍組 8 400 9.88±2.06* 5.74±1.32△

表3 各組不同臟器iNOS陽性細胞數(±s)

表3 各組不同臟器iNOS陽性細胞數(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 N 胰腺正常組 8 3.75±1.26模型組 6 18.00±1.63藻藍蛋白組 8 8.00±1.63 △二甲雙胍組 8 10.50±2.52 △

圖1 大鼠胰腺細胞，HE×200

二甲雙胍具有抗氧化特性，在大動脈內皮細胞中，二甲雙胍可以通過降低NAD(P)H氧化酶或線粒體呼吸鏈的活性而減少ROS產生[11]。Romay等[12]研究表明，藻藍蛋白可以清除烷基、羥基、過氧基，可以抑制由Fe2+、壞血酸致微粒體脂質過氧化，其抗氧化作用與抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)及NO產生有關。Bhat等[13]認為，藻藍蛋白還可以清除ONOO-，且其清除氧自由基作用與其發色團有關。

圖2 大鼠胰島細胞iNOS表達，DAB×400

本實驗表明，糖尿病大鼠模型成功后血糖明顯升高。經過兩周治療，藻藍蛋白組和二甲雙胍組血糖均有所下降，二甲雙胍組、藻藍蛋白組與模型組相比同樣具有統計學意義，說明藻藍蛋白具有降低血糖的作用。另外，本實驗研究證明，經藻藍蛋白治療后的糖尿病大鼠胰島細胞中的iNOS表達，無論是著色程度還是陽性細胞數量上較模型組都明顯呈現弱表達，著色部分主要位于胞漿。結合藻藍蛋白干預組與模型組病理形態學對比，推測，藻藍蛋白很可能從抗氧化方面具有一定的治療2型糖尿病的作用。Bottino等[14]通過分離純化胰島細胞，在體外早期應用抗氧化劑干預胰島細胞，也發現阻斷氧化應激的反應過程可明顯降低胰島細胞的損傷，并可促進胰島細胞的增殖，為2型糖尿病的早期診斷和干預提供了一種新的思路。另外，二甲雙胍與藻藍蛋白均具有降糖、抑制iNOS表達、改善胰島細胞結構的作用，但藻藍蛋白作用靶點是否與二甲雙胍一致，其確切的作用機制尚需探索。藻藍蛋白有望成為治療2型糖尿病的候選藥物，其具體的作用機制、劑量、療程有待進一步研究。

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