正交試驗法優選清瘟敗毒浸膏的提取工藝

湯法銀,樊克鋒,王海波

(1.鄭州牧業工程高等專科學校藥物工程系,河南鄭州450011;2.河南省食品藥品檢驗所,河南鄭州450003)

清瘟敗毒浸膏以2005年版《中國獸藥典》收載“清瘟敗毒散”為基礎,進行加減化裁而得,其主要由金銀花、黃芩、連翹、黃連、石膏等藥組成,具有清熱解毒、瀉火除煩、涼血止痢、扶正祛邪之功效;用于治療畜禽因各種病毒和細菌感染的混合型溫熱病。為了使該方更好的發揮藥物療效,最大限度的保留有效成分,現對其提取工藝進行研究,為該制劑最佳制備工藝的確立提供試驗依據。

1 儀器與材料

美國產 Waters2695型高效液相色譜儀(EMPOWER色譜工作站);色譜柱為 DiamonsiL C18(5 μ m,200×4.6 mm);瑞士產 MET TLER TOLE DO AX205型電子天平;KQ-300超聲波清洗器(江蘇昆山儀器廠)。乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,綠原酸對照品(批號:110753-200413,河南省藥品檢驗所),水(重蒸水),金銀花等藥材(河南省藥材總公司,經鑒定符合《中國獸藥典》2005年版(二部)規定[1]。

2 方法與結果

2.1 提取工藝設計 選用 L9(34)正交表進行試驗,以浸膏得率、綠原酸提取量為考察指標,考查水提取中3個加水量(A)、提取時間(B)和提取次數(C)3個因素,每個因素設3個水平,因素水平安排見表1。

2.2 浸膏的制備 按處方比例,稱取適量金銀花等藥材9份,按正交條件分別進行煎煮,藥液濾過,濾液濃縮并定量至3∶1(藥材∶6浸膏),備用。

2.3 綠原酸的含量測定

表1 正交試驗因素水平

2.3.1 色譜條件[1]流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(13∶87);流速為1 mL/min;檢測波長為327 nm;色譜柱為 DiamonsiLC18(5 μ m,200 ×4.6 mm);柱溫:25℃;理論塔板數不低于2 000。此條件專屬性強,峰純度達到要求,見圖1。按藥典標準,測定原料藥材金銀花中綠原酸含量為1.83%。

2.3.2 對照品和供試品溶液的制備 對照品溶液:精密稱取綠原酸對照品適量,置棕色量瓶中,加50%甲醇制成每毫升含25 μ g的溶液,即得。供試品溶液:精密稱取浸膏0.5 g,置 50 mL量瓶中,加50%甲醇適量超聲處理(功率250W,頻率35 kHz)30 min,放冷后,加 50%甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μ m)過濾,取續濾液作為供試品溶液。

2.3.3 標準曲線 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μ L進樣,以綠原酸進樣量 (μ g)作橫坐標(X),以綠原酸峰面積積分值為縱坐標(Y)繪制標準曲線(見圖2),并對所測得的數據進行回歸分析,回歸方程為Y=1 404 871.20X-5 347.44,相關系數r=0.999 9,說明綠原酸在0.050～0.250 μ g范圍內有良好的線性關系。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液5 μ L,連續進樣5次,在上述色譜條件下測定綠原酸對照品的峰面積,平均峰面積為175 602.5,RSD%=0.73%

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液5 μ L,分別于0、1、2、3、4 h 和 5 h 進樣,測定供試品中綠原酸的峰面積,RSD%=1.16%,說明樣品溶液在5 h內穩定。

2.3.6 重現性試驗 精密稱取同一批浸膏樣品5份,按照供試品溶液制備項下方法制備供試品,各進樣 5 μ L,測定綠原酸峰面積 ,RSD%=1.26%,說明重現性良好。

2.3.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的浸膏樣品6份各0.5 g,置50 mL容量瓶中,分別加入綠原酸對照品,按供試品溶液項制備供試品,進樣5 μ L,測定綠原酸含量,計算回收率。結果平均回收率為99.84%,RSD%=1.07%。

2.3.8 樣品測定 取正交試驗的9份供試品液,分別精密吸取對照品和供試品溶液5 μ L進樣,在上述色譜條件下測定,結果見表2,綠原酸提取方差分析見表3。

2.4 浸膏收率測定 精密稱取浸膏1 g,置已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3 h,移置干燥器中,放置30 min,迅速精密稱定重量,計算收膏率。結果見表2。

從綠原酸提取量指標來看,由直觀分析可知,影響提取效果的因素順序為:提取次數＞加水量＞提取時間,以提取次數影響最大,由此可推出的最佳工藝應為 A2B1C3。從浸膏得率指標來看,由直觀分析可知,影響提取效果的因素順序為:提取次數＞提取時間＞加水量,以提取次數影響最大。由此以可推出的最佳工藝應為A2B3C3。

以綠原酸提取量為主進行方差分析(見表3),加水量和提取時間對提取效果無顯著性分析,提取次數有顯著性影響。以綠原酸提取量指標為主要指標,浸膏得率指標為次要指標,故以確定最佳工藝A2B2C3,即煎煮3次,加8倍量水,時間1.5 h。

2.5 優選提取工藝的重復性試驗 為進一步考察上述優選工藝的穩定性,按上述優化條件進行重復3次試驗。結果見表4。

提取轉移率計算:提取所用藥材中,金銀花中綠原酸含量為1.83%,1 g藥材中標準含量應為18.30 mg綠原酸,而最佳工藝綠原酸平均提取量為11.18 mg,其提取轉移率為11.18÷18.30×100%=61.05%。

3 討論

清瘟敗毒浸膏系中藥復方制劑,成分復雜,綠原酸系本方中君藥金銀花發揮清熱解毒功效的主要成分,因此選做質量控制的指標成分[2]。試驗用正交設計法對清瘟敗毒浸膏的提取工藝進行優選[3],除以測定綠原酸提取率為考核指標外,同時參考干膏的收得率,通過方差分析,水提該方影響綠原酸得率的主因素是提取次數,加水量及提取時間對其無顯著性影響。最終,優選得出用8倍量水,煎煮3次,每次1.5 h為最佳提取工藝,經中試考察,該方法適合于大規模生產。

表2 正交試驗結果

表3 綠原酸提取方差分析

表4 驗證試驗結果

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典(二部)[M].北京:中國農業出版社,2006.

[2]孟日增,石建平,郭娜,等.金銀花中綠原酸的提取工藝及抗菌活性研究[J].中國畜牧獸醫,2007,34(11):144-145.

[3]尚立霞,王妮,劉妍妍.金銀花提取工藝研究[J].食品與藥品,2005,7:41-43.