藻藍蛋白對2型糖尿病大鼠胰島細胞 NFκB和 IκB表達的影響*

張 蕊，馬 璇，劉 琳，劉吉東，沈 衛

近年來倍受關注的炎癥病因學理論認為，2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，細胞因子是導致代謝綜合征的主要原因，而炎癥是胰島素抵抗的觸發因素[1]。甚至在亞臨床階段，慢性炎癥就參與了胰島素抵抗綜合征的發生。在整個炎癥網絡中，核因子 κB（NFκB）是研究的熱點。NFкB 抑制蛋白（IкB）激酶（IKK）／NFκB 炎癥通路活化是導致胰島素抵抗和糖尿病的重要機制之一[2-3]。但對于該通路在胰島細胞中活性變化的研究，國內鮮有報道。藻藍蛋白是螺旋藻中的一種重要活性物質，大量文獻報道其能夠抗炎和調節免疫。初步體外實驗表明，藻藍蛋白具有抗2糖尿病的作用。為此，本實驗建立2型糖尿病大鼠模型，應用藻藍蛋白進行干預，研究其對胰島細胞功能的影響和IкB／NFκB通路活性變化的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型 健康雄性Wistar大鼠32只，鼠齡1個月，體質量130 g~150 g，由青島市藥檢所實驗動物中心提供（SCXK（魯）20030010）。動物均于實驗前置于實驗室適應環境1周，自由飲食，室溫（23±2）℃，自然光照，相對濕度50%~70%。1周后，24只大鼠以高糖高脂飼料（15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、50%普通飼料）喂養，其余8只喂以普通飼料。4周后禁食12 h，高糖高脂組以30 mg/kg劑量1次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）檸檬酸緩沖液，普通飼料組同步注射等量的檸檬酸緩沖液。3周后剪尾取血，測空腹血糖，以血糖值≥7.0 mmol/L為糖尿病模型建立成功，24只大鼠全部造模成功。將24只造模成功的大鼠隨機分為糖尿病模型組、藻藍蛋白組、二甲雙胍組，每組8只，其中模型組2只大鼠于實驗第11周死亡。

1.2 干預措施 實驗第9周開始干預治療。藻藍蛋白粉劑（由中國科學院海洋研究所提供）暗室分裝后-20℃保存，用前加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500 mg/kg體質量灌胃給藥（藻藍蛋白劑量由中國科學院海洋研究所推薦使用），1次/d，連續10 d；二甲雙胍組同步給予蒸餾水稀釋至8%濃度的二甲雙胍，以400 mg/kg連續灌胃10 d。糖尿病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續灌胃10d。

1.3 標本采集及處理 治療結束后(11周初)，各組大鼠頸椎脫臼處死，迅速取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后10%甲醛固定24 h，蒸餾水浸泡4 h。常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機連續切片，厚度5 μm，每隔20片取1片，每個標本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存備用。

1.3.1 血糖 各組動物分別在第造模前、造模后、治療后測空腹血糖（FBG）（mmol/L）。測空腹血糖前夜，大鼠禁食12 h，次日鼠尾靜脈取血，用自動血糖儀（強生醫療器材有限公司，穩豪型）測定空腹血糖。

1.3.2 免疫組化染色 NFκBp65和IκBα親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、3，3-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常規脫蠟至水，蒸餾水浸泡2 min，嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為片狀棕黃色顆粒。對每批染色均同步設立以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）液代替一抗的陰性空白對照。光學顯微鏡（400倍）下，每張切片計數100個胰島細胞，分別記錄其中的陽性細胞數。

2 結果

2.1 空腹血糖 STZ造模后，模型組、藻藍蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與正常組比較明顯升高（P<0.05）。經干預治療后，藻藍蛋白組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖與模型組比較顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖的比較（s）

表1 各組大鼠空腹血糖的比較（s）

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

組別 n 劑量（mg/kg）正常組模型組藻藍蛋白組二甲雙胍組8888--500 400造模后（9周）血糖(mmol/L)3.48±0.50 9.15±3.20△9.75±1.58△9.20±0.36△治療后(11周)血糖(mmol/L)3.91±0.71 8.94±1.90△7.05±0.87*5.74±1.32*

2.2 病理形態學 正常組大鼠胰島為圓形或橢圓形著色淡淺的細胞團，分散于胰腺腺泡之間，數量較多、形狀規則、界限清楚，胰島內細胞排列整齊、大小一致、分布均勻，細胞核大而圓。模型組大鼠胰腺內胰島細胞團數量減少、分布稀疏，殘存胰島萎縮、邊緣皺縮、界限不清，胰島細胞數目減少、空泡增多，部分細胞發生融合、核溶解、聚集邊靠、有的細胞核缺失，只殘留伊紅淺染的細胞質。藻藍蛋白組和二甲雙胍組大鼠胰島細胞病變減輕，胰島細胞團形狀較規則，與模型組有較大改善，但與正常組相比仍有差距，見圖1。

2.3 NFκB的表達 觀察各組大鼠胰島細胞核中NFκB的染色情況。正常組大鼠只局部胰島細胞核有著色；糖尿病模型組大鼠胰島細胞核NFκB表達顯著增強（P<0.05），細胞核呈明顯棕黃色；藻藍蛋白和二甲雙胍干預組大鼠胰島細胞核NFκB的表達較糖尿病模型組均明顯降低（P<0.05），細胞核呈淡黃色。藻藍蛋白組與二甲雙胍組比較，無顯著性差異（P＞0.05），見表 2、圖 2。

圖1 各組大鼠胰島細胞形態和結構，HE×400

表2 各組大鼠NFκB和IκB表達的比較（s）個

表2 各組大鼠NFκB和IκB表達的比較（s）個

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

分組正常組模型組藻藍蛋白組二甲雙胍組n8688 NFκB 10.75±3.62 53.83±6.52△22.13±6.90△*21.50±4.93△*IκB 74.88±8.95 30.67±6.53△42.88±7.68△*43.25±6.69△*

圖2 各組大鼠胰島細胞NFκB的表達，SABC×400

2.4 IκB的表達 觀察各組大鼠胰島細胞漿中IκB的染色情況。正常組大鼠胰島細胞漿呈明顯棕黃色；糖尿病模型組大鼠胰島細胞漿中IκB表達顯著降低（P<0.05），只局部細胞有著色；藻藍蛋白和二甲雙胍干預組大鼠胰島細胞漿IκB的表達較糖尿病模型組均明顯提高（P<0.05）。藻藍蛋白組與二甲雙胍組比較，無顯著性差異（P＞0.05）（圖 3）。

圖3 各組大鼠胰島細胞IκB的表達，SABC×400

3 討論

3.1 藻藍蛋白對糖尿病大鼠胰腺中IкB/NFκB通路的影響 NFκB是一種對眾多炎癥因子的轉錄具有調控作用的蛋白質分子。靜息狀態時，NFκB與其抑制蛋白IкB結合，以無活性的形式定位于細胞漿之中。高血糖、高游離脂肪酸、糖基化終末產物、感染等因素導致機體氧化應激增強，激活IкB激酶（IKK）。活化后的IKK使IкB降解從而與NFκB分離，NFκB移位進入細胞核中，與DNA鏈上特異部位結合，啟動基因轉錄[4]。多種炎癥因子和炎癥酶靶基因的轉錄，如 TNFα、IL2、IL18、NOS、COX-2 等，使得這些炎癥因子和酶過度表達，造成胰島炎性浸潤，胰島β細胞功能障礙和糖尿病及其并發癥的產生。大量文獻表明NFκB與糖尿病腎病和大血管并發癥的發生密切相關[5-7]。用NFκB的活性抑制劑吡咯烷二硫基甲酸酯（PDTC）抑制其活性能延緩糖尿病腎病的發展[8]。大鼠胰腺是STZ毒性損傷的靶器官，STZ可以通過一氧化氮和自由基等途徑損傷胰島β細胞誘發糖尿病，而自由基是激活NFκB的因素之一。由此推測，糖尿病大鼠胰腺中有IкB/NFκB通路的活化。

實驗NFκB免疫組化結果可見，正常組大鼠胰島細胞團中胰島細胞漿呈明顯棕黃色著色，只局部胰島細胞核有著色，而糖尿病大鼠胰島細胞團中胰島細胞核呈明顯棕黃色著色，細胞漿幾乎不著色。IκB的免疫組化結果顯示，正常組大鼠胰島細胞漿呈深棕黃色著色，細胞核幾乎不著色，而糖尿病組大鼠胰島細胞核、漿幾乎都不著色。這體現了糖尿病大鼠胰島細胞中IκB被降解后，激活的NFкB從細胞漿到細胞核的轉移過程。藻藍蛋白干預組大鼠胰島細胞核NFκB表達較糖尿病組明顯減輕，而IκB表達增強，說明干預后IκB的活性可能有所恢復，NFκB在胰島細胞核中的表達降低。提示藻藍蛋白可能具有抑制IкB/NFκB通路活化的作用。

3.2 藻藍蛋白對糖尿病胰腺的保護作用 藻藍蛋白是螺旋藻細胞中重要的光合作用天然色素，在螺旋藻中的含量高達10%～20%。近年來國內外人員研究表明,藻藍蛋白具有抗疲勞、抗輻射、抑制腫瘤、降低血脂、調節免疫、抗炎等多種功能且安全無毒。Romay等[9-10]第一次報道了藻藍蛋白具有抗炎、清除氧自由基的作用,他們研究證明藻藍蛋白在12種炎癥實驗模型中表現出抗炎效應。藻藍蛋白可以清除烷基、羥基、過氧基,可以抑制由亞鐵離子（Fe2+）、壞血酸致微粒體脂質過氧化，其抗氧化作用與抑制腫瘤壞死因子 α（TNFα）及一氧化碳（NO）產生有關[9]。二甲雙胍是應用多年的抗2型糖尿病一線藥物，它可以抑制高糖所誘發的炎癥反應[11]，通過抑制NFκB的活化而減弱ILβ/TNFα誘導的培養皿中血管壁細胞（EC、單核細胞等）炎癥細胞因子的表達，提示其具有直接的抗炎作用。但臨床上長期應用二甲雙胍會造成一定的毒副作用。本實驗觀察到藻藍蛋白有類似二甲雙胍的作用，可明顯抑制糖尿病大鼠胰島細胞中有IкB/NFκB通路的活性，具有一定的胰島細胞保護作用，其機制可能為：減少IKK激活導致的IκB磷酸化和降解，抑制NFκB介導的基因轉錄，降低TNFα、IL2、IL6等炎癥因子的表達和NOS催化的NO表達從而減少胰島細胞炎癥；降低血脂，減輕脂質過氧化，清除各種自由基，保護胰島細胞。藻藍蛋白可以顯著降低糖尿病大鼠的血糖，降低血糖的程度不如二甲雙胍，可能因為：藻藍蛋白具有獨立的、不依賴于降糖作用的抗炎、抗氧化應激機制，藻藍蛋白的降糖作用更為緩和，故在干預期間降糖效果不如二甲雙胍。

綜上所述，藻藍蛋白表現出抗2型糖尿病的藥理作用且無毒副作用，因此可能成為今后新型的治療2型糖尿病的藥物或功能性食品。

參考文章：

[1]Dandona P,Aljada A,Bandyopadhyay A.Inflammation:the link between insulin resistance,obesity and diabetes[J].Trends I mmunol,2004,25(1):4-7.

[2]Blaak EE.Fatty acid metabolism in obesity and type2 diabetes mellitus[J].Proc Nutr Soc,2003,62(3):753-760.

[3]Miyaoka K,Kuwasako T,Hirano K,et al.CD36 deficiency associated with insulin resistance[J].Lancet,2001,357(9257):686-687.

[4]Tucker Collins,Myron I,Cybulsky.The NF-kappaB signal transduction pathway in aortic endothelial cells is primed for activation in regions predisposed to atherosclerotic[J].Clin Invest,2001，107(3):255-256.

[5]Mensah-Brown EP,Obineche EN,Galadari S,et a1.Streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats:the role of inflammatory cytokines[J].Cytokine,2005,3l(3):180-190.

[6]Navarro JF,Mora C.Role of inflammation in diabetic complications[J].Nephrol Dial Transplant,2005,20(12):2601-2604.

[7]Monaco C,Andreakos E,Kiriakidis S et al.Canonical pathway of nuclear factor кppa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004;101(15):5634-5639

[8]丁鶴林,黎鋒,徐明彤.抑制核因子κB對糖尿病腎病的作用[J].中華內科雜志,2002,41(9):605-609.

[9]Romay Ch,Gonzalez R,Ledon N,et al.C-phycocyanin:a biliprotein with antioxidant,anti-inflammatory and neuroprotective effects[J].Curr Protein Pept Sci,2003,4(3):207-216.

[10]Romay Ch,Ledon N,Gonzalez R.Effects of phycocyanin extract on prostaglandin E2 levels in mouse ear inflammation tests[J].Arzneimittelforschung,2000,50(12):1106-1109.

[11]Haffner S,Temprosa M,Crandall J,et al.Intensive lifestyle intervention or metformin on inflammtion and coagulation in participants with impaired glucosa tolerance[J].Diabetes,2005,54(5):1566-1572.