大孔吸附樹(shù)脂提取分離去甲基萬(wàn)古霉素的工藝研究

去甲基萬(wàn)古霉素是我國(guó)唯一一個(gè)自主研制并成功應(yīng)用于臨床的糖肽類(lèi)抗生素，其結(jié)構(gòu)比萬(wàn)古霉素在亮氨酸部位少 1 個(gè)甲基，見(jiàn)圖1。

圖1 去甲基萬(wàn)古霉素結(jié)構(gòu)式

去甲基萬(wàn)古霉素具有和萬(wàn)古霉素相同的抗菌譜和相似的抗菌活性，對(duì)耐青霉素G及多種抗生素的金葡球菌、表球菌、溶血性鏈球菌、草綠色鏈球菌、肺炎球菌及腸球菌等均有強(qiáng)大的抗菌作用,對(duì)厭氧的難辨梭狀芽孢桿菌亦有較好的抗菌作用,對(duì)炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌等亦敏感,屬速效殺菌藥[1]。

目前萬(wàn)古霉素的分離純化方法有大孔樹(shù)脂吸附分離法[2]、沉淀法[3]、色譜制備法[4]、磁性親和吸附法[5]、雙水相萃取法[6]、反膠團(tuán)萃取法[7]等，也可將其中幾種方法綜合運(yùn)用[8]。色譜制備法、磁性親和吸附法成本較高，雙水相萃取法、沉淀法、反膠團(tuán)萃取法影響因素較復(fù)雜，提取率不高。大孔樹(shù)脂吸附分離法較其它方法具有一定的優(yōu)越性：(1)影響因素少，工序簡(jiǎn)單，操作方便；(2)提取率高，去除雜質(zhì)能力強(qiáng)；(3)適用于工業(yè)化生產(chǎn)。由于去甲基萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素物化性質(zhì)極為接近，因此，作者采用大孔樹(shù)脂吸附分離法提取發(fā)酵液中的去甲基萬(wàn)古霉素，并優(yōu)化了相關(guān)的工藝參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

發(fā)酵液，華北制藥新藥公司。

去甲基萬(wàn)古霉素對(duì)照品，SIGMA公司；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為工業(yè)級(jí)；HZ801型、HZ802型、HZ803型、HZ820型、HZ816型樹(shù)脂，上海華震公司；NKA型、S-8型樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠；XAD-16型樹(shù)脂，上海羅門(mén)哈斯化工公司。

高效液相色譜儀，Waters公司。

1.2 預(yù)處理

1.2.1 發(fā)酵液預(yù)處理

取發(fā)酵液加2 mol·L-1鹽酸調(diào)pH值至3.5，然后加入一定量的助濾劑過(guò)濾，濾液作為上柱液備用。

1.2.2 樹(shù)脂的預(yù)處理/再生

新(再生)樹(shù)脂首先用4 BV工業(yè)酒精浸泡24 h,用純化水洗至無(wú)醇味；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液攪拌浸泡3 h，用純化水洗至中性；然后用3 BV 2 mol·L-1HCl溶液攪拌浸泡3 h,用純化水洗至中性；再用3 BV 2 mol·L-1NaOH溶液浸泡3 h，用純化水洗至中性，待用。

1.3 吸附條件研究

1.3.1 樹(shù)脂的篩選

取已處理好的8種樹(shù)脂,分別裝入50 mL樹(shù)脂柱(R∶H=1∶5)中,取同一批號(hào)的去甲基萬(wàn)古霉素上柱液，分別在常溫下以1.5 BV·h-1的流速上樣，保證樹(shù)脂吸附飽和或過(guò)飽和，分別測(cè)定飽和吸附量。

式中:V0為濕樹(shù)脂體積；c0為上柱液濃度；c1為10%上柱液濃度；V1為當(dāng)流出液濃度為10%上柱液濃度時(shí)的流出液總體積。

1.3.2 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

將去甲基萬(wàn)古霉素上柱液用水稀釋成濃度為0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、2.2 mg·mL-1、2.8 mg·mL-1的上樣液，以1.5 BV·h-1的流速上樣，考察上樣液濃度對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響。

分別用5%鹽酸或10%的氫氧化鈉將去甲基萬(wàn)古霉素上柱液 (濃度為2.2 mg·mL-1，pH值為3.5)的pH值調(diào)至3.0、4.0、6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0，以1.5 BV·h-1的流速上樣，考察上樣液的pH值對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響。

將pH值為9.0、濃度為2.2 mg·mL-1的去甲基萬(wàn)古霉素上柱液上HZ816樹(shù)脂柱吸附，上樣流速(BV·h-1)分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3和4，考察上樣流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響。

1.4 解吸條件研究

選用甲醇、乙醇、丙酮三種溶劑進(jìn)行靜態(tài)解吸，篩選效果最好的解吸劑。

取一定量的HZ816樹(shù)脂濕法裝入100 mL玻璃樹(shù)脂柱(R∶H=1∶5)中，通上樣液吸附，當(dāng)流出液濃度接近上樣液濃度10%時(shí)，認(rèn)為樹(shù)脂已吸附飽和并停止上樣，用純化水洗滌樹(shù)脂后，然后選用5%乙醇-0.1%鹽酸-水、10%乙醇-0.1%鹽酸-水、15%乙醇-0.1%鹽酸-水、20%乙醇-0.1%鹽酸-水、25%乙酸-0.1%鹽酸-水解吸，解吸流速控制在100 mL·h-1，合并高濃度的解吸液，并以HPLC檢測(cè)流出液濃度。

1.5 HPLC色譜條件

色譜條件：色譜柱 Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為40℃，流動(dòng)相為乙腈∶0.05 mol·L-1KH2PO4=8∶92(體積比)，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL。在該色譜條件下去甲基萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間為9.5 min。

稱(chēng)取27 mg去甲基萬(wàn)古霉素對(duì)照品配制成50 mL水溶液，取對(duì)照品溶液20 μL注入色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算峰面積。本方法測(cè)得去甲基萬(wàn)古霉素平均回收率為99.8%(n=5)，RSD=0.15%；精密度為99.88%(n=5)，RSD=0.20%。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹(shù)脂篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中測(cè)得8種大孔樹(shù)脂的飽和吸附量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 8種大孔樹(shù)脂的飽和吸附量

從表1可見(jiàn)，HZ816樹(shù)脂的飽和吸附量最高。因此，選取HZ816型樹(shù)脂作為去甲基萬(wàn)古霉素的吸附樹(shù)脂。

2.2 吸附條件對(duì)HZ816樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響

2.2.1 上樣液濃度(圖2)

圖2 上樣液濃度對(duì)HZ816樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響

由圖2可以看出，去甲基萬(wàn)古霉素濃度對(duì)HZ816樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量有一定的影響。當(dāng)上樣液濃度較低(如0.8 mg·mL-1)時(shí)，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量較低，這說(shuō)明仍有部分樹(shù)脂未參與吸附過(guò)程，樹(shù)脂使用率不高；當(dāng)上樣液濃度為2.2 mg·mL-1時(shí)，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量最高；而當(dāng)上樣液濃度過(guò)高時(shí)，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量也稍有下降，這可能是由于一些雜質(zhì)與萬(wàn)古霉素競(jìng)爭(zhēng)吸附，從而影響了樹(shù)脂對(duì)萬(wàn)古霉素的吸附。選擇較適上樣液濃度為2.2 mg·mL-1。

2.2.2 上樣液pH值(圖3)

圖3 上樣液pH值對(duì)HZ816樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響

由圖3可以看出，上樣液pH值為9.0時(shí)，HZ816樹(shù)脂對(duì)去甲基萬(wàn)古霉素的動(dòng)態(tài)飽和吸附量較高。這可能是由于去甲基萬(wàn)古霉素呈弱堿性，在弱堿性條件下能夠保持分子狀態(tài)，較易被吸附。因此，選擇較適上樣液pH值為9.0。

2.2.3 上樣流速(圖4)

圖4 上樣流速對(duì)HZ816樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量的影響

由圖4可以看出,當(dāng)上樣流速超過(guò)2.5 BV·h-1后，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)飽和吸附量逐漸下降。流速越慢,吸附越好；但流速過(guò)慢會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期,提高成本。因此，選擇較適的上樣流速為2 BV·h-1。

2.3 解吸條件的確定

2.3.1 解吸溶劑的選擇

解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙醇和甲醇均具有較好的解吸能力,因乙醇毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于甲醇,故選用乙醇作為吸附樹(shù)脂的解吸溶劑。

2.3.2 解吸劑的確定(表2)

表2 解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，用較低含量乙醇解吸時(shí)解吸拖尾嚴(yán)重，解吸率低，這可能是由于有機(jī)溶媒含量低時(shí)，一方面樹(shù)脂的溶脹度不夠，去甲基萬(wàn)古霉素從內(nèi)孔的溶出受阻，另一方面流動(dòng)相對(duì)去甲基萬(wàn)古霉素的溶解度低，致使其難以進(jìn)入流動(dòng)相而滯留于樹(shù)脂；隨著乙醇含量的上升，解吸率明顯增加，所需解吸液體積減少。用15%乙醇-0.1%鹽酸-水解吸時(shí),解吸液甲基萬(wàn)古霉素的色譜純度最高，表明此時(shí)的雜質(zhì)最少。綜合考慮解吸率和解吸液色譜純度，選取15%乙醇-0.1%鹽酸-水作為解吸劑。

2.4 工藝驗(yàn)證

本工藝經(jīng)過(guò)5批中試放大，結(jié)果表明：大孔吸附樹(shù)脂HZ816可以很好地提取分離去甲基萬(wàn)古霉素，動(dòng)態(tài)飽和吸附量達(dá)36.1 mg·mL-1，可將發(fā)酵液中去甲基萬(wàn)古霉素濃度富集15倍左右；純化水洗樹(shù)脂柱后，采用15%乙醇-0.1%鹽酸-水溶液對(duì)樹(shù)脂柱解吸，解吸液去甲基萬(wàn)古霉素較集中，基本不拖尾，平均解吸率92.0%；去甲基萬(wàn)古霉素色譜純度由發(fā)酵液的低于20%提高到解吸液的85.0%，表明發(fā)酵液中大量色素、蛋白、多糖等雜質(zhì)得以有效去除，為后續(xù)進(jìn)一步純化精制打下了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

選擇HZ816型樹(shù)脂為去甲基萬(wàn)古霉素的吸附樹(shù)脂，在上樣液濃度為2.2 mg·mL-1、pH值為9.0、上樣流速為2 BV·h-1的最佳吸附條件下，HZ816型樹(shù)脂對(duì)去甲基萬(wàn)古霉素的吸附量達(dá)36.1 mg·mL-1；采用15%乙醇-0.1%鹽酸-水即可將吸附在樹(shù)脂柱上的去甲基萬(wàn)古霉素有效解吸，解吸率達(dá)92.0%。該工藝簡(jiǎn)單、易操作，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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