高效液相色譜法檢測泰樂菌素殘留

泰樂菌素(Tylosin)是由美國學者Hamill于1959年自弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)合成并研制得到的十六環大環內酯抗生素，為畜禽專用抗生素，應用廣泛[1，2]。泰樂菌素藥渣是發酵液預處理進行固液分離時形成的菌餅部分，其中可被動物利用的營養成分很多[3]，但動物食用殘留抗生素的藥渣以后，不僅會破壞動物體內原有的微生態平衡、產生耐藥菌，還可通過環境和食物鏈的作用對人體健康造成危害。基于以上原因，本課題組篩選出泰樂菌素降解菌處理泰樂菌素藥渣，以使其可代替大豆、玉米等原料生產酵母培養物和飼用酶制劑。我國農業部于2001年發布《飼料藥物添加劑使用規范》中規定每噸飼料的泰樂菌素添加量(均以有效成分計)是:豬10～100 g，雞4～50 g，連用5～7 d，休藥5 d。

作者在此運用高效液相色譜法檢測利用泰樂菌素藥渣生產的酵母培養物和飼用酶制劑中泰樂菌素含量，為開發利用抗生素藥渣提供依據。

1 實驗

1.1 主要試劑和儀器

泰樂菌素標準品，Sigma公司；甲醇、正己烷、磷酸、十二水磷酸氫二鈉，均為分析純；乙腈、甲醇，色譜純。

LC-8A型高效液相色譜儀、SPD-20A型可變波長紫外-可見檢測器，日本島津公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；DZF-1型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；PHS-3B型精密酸度計，上海精密科學儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；HH.SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋，北京長源實驗設備廠；UV-1100型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 溶液的配制

泰樂菌素標準儲備液:準確稱取適量泰樂菌素標準品,用甲醇配成1000 mg·L-1的標準儲備液,4℃避光保存，用0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)稀釋至適當濃度,作為標準工作液,4℃冰箱保存。

磷酸鹽緩沖溶液A：準確稱取13.4703 g十二水磷酸氫二鈉，溶解，用水稀釋至1 L，磷酸調節pH=2.4。

磷酸鹽緩沖溶液B：準確稱取3.6176 g十二水磷酸氫二鈉，溶解，用水稀釋至250 mL，磷酸調節pH=6.5。

1.3 樣品溶液的配制

1.3.1 樣品脫脂

樣品脫脂采用索氏提取法。稱取一定量粉碎后的樣品，用濾紙包好放入索氏提取器中，加入適量正己烷，75℃水浴脫至無色，取出晾干，備用。

1.3.2 樣品的提取

準確稱取脫脂后樣品1.00 g于50 mL塑料離心管中，加入甲醇10 mL，超聲提取30 min， 4℃、8000 r·min-1離心10 min，移出上清液，殘渣再提取2次，合并3次提取液， 4℃、4500 r·min-1離心5 min，上清液移入100 mL圓底燒瓶中，35℃旋轉蒸發至有少量殘渣,用5 mL 0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30)溶解，過0.45 μm濾膜，供高效液相色譜檢測。

1.4 高效液相色譜條件

檢測波長:285 nm;色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm);流動相：A液∶乙腈;B液：0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)[4]，A液∶B液=34∶66(體積比);過0.45 μm濾膜;等度洗脫;流速：1 mL·min-1;進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

用0.04 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5)-乙腈(70∶30,體積比)的溶液，將泰樂菌素標準儲備液分別稀釋成10 mg·L-1、15 mg·L-1、20 mg·L-1的溶液，在270～295 nm范圍內[5～7]，每隔5 nm測一次吸光度，結果見圖1。

圖1 不同波長下不同濃度泰樂菌素的吸光度值

由圖1可知，泰樂菌素在波長285 nm處有最大吸光度，因此本實驗選擇泰樂菌素的檢測波長為285 nm。

2.2 樣品的前處理

經測試，抗生素藥渣偏酸性，嘗試了以乙腈、甲醇為提取劑，乙腈效果最好，甲醇次之，從經濟角度出發，選擇甲醇為提取劑。

用藥渣生產的酵母培養物和飼用酶制劑的油脂含量高，由于甲醇和正己烷部分互溶，因此選擇索氏提取法，先用正己烷脫脂，再用甲醇提取。

2.3 方法的線性范圍、檢出限

方法的最小檢測限(以信噪比S/N=3計)為0.31 mg·L-1，定量限(以信噪比S/N=10計)為0.58 mg·L-1。在0.75～50 mg·L-1范圍內,其標準曲線方程為y=24195x-4782.4,相關系數R2=0.9993，表明峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

2.4 回收率及精密度

稱取一定量的干麩皮，添加10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-13個水平，每個樣品重復測試5次，結果見表1。

表1 泰樂菌素平均加標回收率和相對標準偏差(n=5)

由表1可知,平均回收率為47.25%～75.92%,相對標準偏差為2.45%～8.53%(n=5)。

2.5 樣品的高效液相色譜圖及檢測結果

飼用酶制劑原料由泰樂菌素藥渣、麩皮等組成,在其中接入泰樂菌素降解菌和黑曲霉，經一定時間發酵處理后，得飼用酶制劑。酵母培養物原料由泰樂菌素藥渣、玉米淀粉等組成，在其中接入泰樂菌素降解菌和酵母菌，經一定時間發酵處理后，得酵母培養物。

按照1.3方法處理，測定了實驗室生產的酵母培養物和飼用酶制劑的泰樂菌素含量，結果見表2；其高效液相色譜圖見圖2。

表2 酵母培養物和飼用酶制劑的泰樂菌素殘留檢測結果

圖2飼用酶制劑原料(a)、飼用酶制劑(b)、酵母培養物原料(c)、酵母培養物(d)、泰樂菌素標準品(e)的高效液相色譜圖

Fig.2HPLCchromatogramsoffeedenzymestuff(a),feedenzyme(b),yeastculturestuff(c),yeastculture(d),tylosinstandard(e)

由圖2可以看出，發酵前后泰樂菌素與其它化合物的分離度均很好，該方法適用于實驗室生產的酵母培養物和飼用酶制劑中泰樂菌素殘留的檢測。

3 結論

建立了酵母培養物和飼用酶制劑中殘留泰樂菌素的高效液相色譜檢測方法。泰樂菌素的檢出限為0.31 mg·L-1,在0.75～50 mg·L-1范圍內線性相關系數R2=0.9993。在10 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1添加水平的回收率為47.25%～75.92%,相對標準偏差為2.45%～8.53%。本實驗為檢測用藥渣制得的飼用酶制劑及酵母培養物的泰樂菌素殘留提出了新方法，該方法簡便、高效、具有一定的參考價值，為抗生素藥渣的進一步綜合治理和開發利用提供了依據。

參考文獻：

[1] 王海洲.泰樂菌素在養殖業中的應用[J].畜牧業,2002,(6): 18.

[2] 趙東峰,任翔,朱麗.泰樂菌素及其衍生物研究進展[J].醫藥產業資訊,2006,3(15):46-48.

[3] 李雪紅,張煌濤，占秀梅.動物性食品中大環內酯類抗生素殘留分析綜述[J].草食家畜,2006,(3):10-12.

[4] Prats C,Francesch R,Arboix M,et al.Determination of tylosin residues in different animal tissues by high performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography B,2002，766(1):57-65.

[5] 孔科,袁宗輝,范盛先,等.高效液相色譜法檢測泰樂菌素在肉雞組織中的殘留[J].中國獸醫學報,1999,19(5): 489-491.

[6] 王海濤,張睿,段宏安,等.高效液相色譜法同步檢測牛奶中替米考星、泰樂菌素和螺旋霉素殘留量[J].分析試驗室,2008,27(7): 98-101.

[7] 何綺霞，葉瑞英.HPLC法測定復方制劑中的酒石酸泰樂菌素[J].中國獸藥雜志，2002,36(6): 29-30.