環境污染物與生物大分子相互作用的光譜法研究進展

研究表明，環境因素是導致人類腫瘤的重要誘因之一。隨著科學的發展與社會的進步,越來越多的化合物進入了人類的生產和生活環境。外源小分子與蛋白質、核酸等生物大分子相互作用的研究涉及許多相關學科，如生物學、化學、醫學、藥物化學、物理學及計算化學等，一直是相關交叉領域的研究熱點。一般而言，外源小分子與生物大分子的靶部位作用后，將使后者發生變化，繼而引起一系列生物體內的物理變化或化學變化，最終體現為效應。血清白蛋白、DNA與小分子間的超分子作用，因其在藥物設計與合成及藥物作用機理研究等方面的重要意義，引起了眾多學者的關注。作者在此對環境污染物與生物大分子相互作用的研究現狀進行了綜述，重點介紹了光譜法研究進展。

1 環境污染物與DNA相互作用的研究現狀

靶向分子與DNA結合的部位是DNA的堿基、磷酸骨架和戊糖環，即DNA由平行的堿基、聚陰離子磷酸骨架以及大溝和小溝組成了靶向分子識別的位點。非共價鍵結合主要包括靜電、溝區、插入等幾種作用方式。

早在20世紀60年代，人們就發現蒽環化合物的蒽環平面可以嵌入DNA而形成加合物。一些致癌物也能與DNA形成加合物，這種DNA加合物都是由DNA經轉錄、翻譯等過程產生的，也是可能癌變的預警標志物質。因此，環境化學污染物與DNA相互作用的研究對于揭示某些基因突變的原因、尋找快速測定基因突變的方法以及相應的基因治療藥物具有重要意義。目前，國內外在此領域研究報道尚不多，環境污染物與DNA相互作用研究總結見表1。

表1 環境污染物與DNA的相互作用

環境化學物質有機磷、氨基甲酸酯類農藥[1～7](如馬拉硫磷、甲萘威、毒死蜱、氰戊菊酯)以及環境污染物蒽[8]等與DNA的作用已見諸報道。任麗萍等[9]發現阿特拉津-ctDNA在319.8 nm處有一增強的共振光散射光譜峰，且共振光散射強度與ctDNA的濃度呈線性關系，據此建立了測定痕量DNA的方法。段云青等[19]研究了抗凝殺鼠劑溴鼠靈與小牛胸腺DNA的相互作用。這些研究表明，小分子化合物與DNA的結合模式主要是通過靜電、溝區、插入等非共價鍵方式結合，如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水作用等。雖然這些均屬于弱作用鍵，但在分子水平的生命現象中卻是決定性的因素。

2 環境污染物與蛋白質相互作用的研究現狀

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是人和動物體內血液中含量最豐富的蛋白質，容易較大量、高純度地制備。同其它蛋白質比較，SA分子量較小、溶解性較大、穩定性較好、帶有凈負電荷，且能與體內許多內源性物質及許多外源小分子配體相互結合，因而成為研究蛋白質在體內代謝、生物學功能、臨床應用及遺傳變異等方面的理想蛋白質，也是此類研究中應用最為廣泛的蛋白質。環境污染物進入人體后，先與SA結合，然后被轉運到其它組織部位釋放出來，產生危害作用。近年來，國內外學者主要集中于研究污染物的宏觀毒性，關于其與生物分子特別是典型的生物大分子SA的相互作用則鮮有報道。環境污染物與血清白蛋白相互作用研究總結見表2。

表2 環境污染物與血清白蛋白的相互作用

Purcell等[20]研究了除草劑阿特拉津和2,4-二氯取代的阿特拉津與人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)的相互作用，發現二者均引起蛋白質的二級結構發生變化，α-螺旋結構減少，β-折疊以及其它結構增加。百草枯是一種速效觸殺型滅生性除草劑，對人畜毒性較強[21]。顏承農等[22]和Zhang等[23]分別采用紫外和熒光方法詳細研究了百草枯與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)及HSA的相互作用。王月等[24]模擬環境中的復雜體系，通過測定典型有機污染物鄰、間、對硝基苯胺共存時與BSA的相互作用結合常數，評價三種硝基苯胺共存時與BSA結合強度的大小，建立了一種基于分子水平親和作用原理的快速毒性評價方法。

3 外源分子與蛋白質或DNA相互作用的光譜研究方法

DNA分子中的堿基和蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等氨基酸殘基都具有特殊的光學活性。許多外源小分子或本身具有光學活性，或與SA和DNA大分子結合后產生光學活性，因此用光譜方法通過考察SA和DNA大分子結合小分子后結構上的變化來研究結合機理，是非常有效和應用最廣泛的方法。常用的光譜法包括紫外可見光譜法、熒光光譜法、紅外光譜法和圓二色光譜法等。

3.1 紫外可見光譜法(UV-Vis spectrum)

DNA分子的紫外可見光譜在260 nm左右有最大吸收。許多外源分子與DNA結合后，DNA或外源分子的吸收光譜都會發生變化，如引起吸收帶的紅移(藍移)現象或增色(減色)效應，因此，用紫外可見吸收光譜法來研究DNA與外源分子的結合機理，是非常有效和應用廣泛的方法。劉偉等[3]利用吸收光譜法對毒死蜱、氰戊菊酯和馬拉硫磷與DNA作用的研究表明，三者均能引起DNA的紫外譜圖發生波長位移和減色效應，推斷它們可能加合到DNA的親核位點，對DNA造成損傷。孫英等[5]對3種氨基甲酸酯類農藥與ctDNA作用的紫外光譜研究表明，它們能插入DNA的螺旋雙鏈，通過形成DNA加合物的形式導致基因突變，最終對生物體的DNA產生化學損傷。同樣，一些小分子配體與蛋白質結合后,其分子結構發生了一定的變化，相應出現了吸收峰位移或譜峰寬度的變化，據此可研究蛋白質與小分子間的結合強弱和結合機理。童沈陽等應用吸收光譜法對多種染料與蛋白質BSA的結合反應機理及結合參數進行了系統研究[34～36]。

3.2 熒光光譜法(Fluorescence spectrum)

蛋白質分子中含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)三種芳香族氨基酸殘基，在紫外光照射下會發射熒光(圖1)，所以蛋白質屬于內源性熒光物質，可直接根據作用物對其內源熒光的猝滅或加強程度來考察相互作用的機理及結合強度；熒光測試中的發射峰特征、能量轉移等指標可為蛋白質分子中熒光生色基團的結構及其所處的微環境研究提供有用信息；根據能量轉移機理，可以求出結合于蛋白質的外源分子距蛋白質中色氨酸的距離;通過外源分子與結合部位已知的熒光探針競爭蛋白質結合部位，可以確定藥物在蛋白質上的結合部位;利用熒光探針，可以研究蛋白質分子的構象。由于熒光探針具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便等優點，近年來在蛋白質分子構象研究中得到越來越廣泛的應用。Demant[37]研究了BSA與7-羥基香豆素-4-乙酸所形成的共價配合物BSA-HCA的熒光性質，并以此化合物為熒光探針建立了定量測定脂肪酸的方法。Yang等[38,39]在發展蛋白質與小分子化合物相互作用的熒光研究法及熒光探針方面做了大量工作。

圖1 血清白蛋白中Trp、Tyr及Phe的熒光光譜

DNA雖無內源熒光，但可通過熒光探針法來研究其與熒光體或其它化合物的作用，小分子與DNA的鍵合方式也直接影響著穩態熒光光譜[40,41]。溴化乙錠是應用最早的熒光探針，被廣泛應用于抗癌藥物的篩選和小分子與DNA作用的研究[41,42]。Zhou等[43]應用熒光法研究了胺類化合物與DNA的相互作用模式。通過考察典型熒光猝滅劑如KI和K4Fe(CN)6對小分子熒光的猝滅作用也可以判斷小分子與DNA之間的作用方式。當小分子與DNA屬于嵌插作用時，猝滅劑的猝滅作用減弱；而當小分子與DNA屬于溝槽作用時，猝滅作用增強。

三維熒光光譜法是近20年來發展起來的熒光分析新技術。它不僅可以提高測量的靈敏度和對分子結構的選擇性，而且能夠更加全面地展現樣品的熒光信息，有利于綜合考察樣品的組分分布及構型變化特征，能直觀地觀察Trp殘基在蛋白質分子的微環境中以及不同條件下的構象變化，有望得到廣泛的應用。鄢遠等[44]將三維熒光光譜法用于測定溶液狀態下蛋白質的構象，顏承農等[22]研究發現百草枯存在時，BSA三維光譜峰出現不同程度的降低，大劑量百草枯可對BSA構象產生嚴重影響，從而使BSA失去活性功能。

3.3 熒光偏振技術(Fluorescence polarization)

偏振是熒光分子按照偏振激發方向的光取向的結果。在粘度小的溶劑(如水)中，當激發光位于熒光分子主吸收帶且沒有發生分子間能量損失時，其偏振度與熒光分子的轉動速度有關，轉動速度快，熒光偏振??；反之，轉動速度慢，熒光偏振大。對熒光樣品進行退偏振觀測可用來確定蛋白質的變性作用、蛋白質和小分子配體的結合反應以及蛋白質的旋轉速率等。一般而言，蛋白質的偏振度降低，說明離子與蛋白質之間發生了相互結合作用[45]。小分子與DNA作用后熒光偏振的變化情況也是判斷小分子是否與DNA發生嵌插作用的一個標準。通常當小分子嵌插到堿基中時，其轉動受阻，熒光偏振會隨之變大，而非嵌插作用不會引起熒光偏振的增大[46]。

3.4 同步熒光技術(Synchronization fluorescence spectrum)

同步熒光技術是在同時掃描激發和發射波長的情況下測繪熒光光譜圖，可以提供熒光功能團附近微環境的變化。Miller[47]用同步熒光技術分別測得蛋白質分子中Trp和Tyr的特征光譜，而用普通的熒光光譜就無法獲得。Δλ為15 nm 的同步熒光光譜圖顯示了蛋白質中酪氨酸殘基的光譜特征，而Δλ為60 nm 的同步熒光光譜圖僅表現出色氨酸殘基的光譜特征[48～50]。氨基酸殘基的最大熒光波長與其所處環境的疏水性有關，如果氨基酸所處環境的疏水性降低，則其最大發射波長紅移，所以由熒光波長的改變可判斷蛋白質二級結構(構象)的變化[51]。周能等[52]研究了蘇丹Ⅰ與BSA的作用，結果表明，隨蘇丹Ⅰ濃度的增大，Trp和Tyr殘基的同步熒光光譜的最大波長保持不變，說明蘇丹Ⅰ的加入沒有引起BSA的構象變化，但蘇丹Ⅰ更易靠近Trp殘基。

3.5 共振 Rayleigh 散射光譜(Resonance Rayleigh scattering，RRS)

共振 Rayleigh 散射光譜也稱瑞利光散射(RLS)，是一類入射光與反射光波長相同的光散射，屬于同步發光。自從1993年Pasternack等[53]首次用共振光散射技術對卟啉類化合物在核酸上的聚集進行研究之后，揭開了光散射技術在分析化學方面應用的序幕并使光散射技術逐步成為儀器分析方面的重要補充。Feng等[54]、劉紹璞[55]利用卟啉、染料等在蛋白質、核酸等生物大分子上聚集組裝時產生的RRS信號與生物大分子濃度之間的線性關系，建立了RRS測定生物大分子的新分析方法，從而開辟了RRS在分析化學中的應用新領域。馬春琪等[56]指出RRS信號改變可歸結為兩個原因，即散射體幾何尺寸的變化和散射體電子離域程度的變化。

3.6 圓二色光譜(Circular dichroism，CD)

圓二色光譜以高頻變換的左旋或右旋偏振光作為入射光，為有機化合物的絕對構型、構象和反應機理的研究提供了很多信息。B型DNA 圓二色光譜圖(圖2)中有一強度相當的正峰和負峰，275 nm處強的正峰是由于DNA的堿基對堆積而產生的，245 nm處的負峰是由于DNA的雙螺旋結構而產生的[57,58]。因此，當外源物質加入到DNA中時，根據DNA圓二色光譜圖峰的變化可以判斷外源小分子對DNA結構的影響。而對一些本身沒有CD信號，但與DNA結合后能產生誘導CD信號的分子，也可獲得一定的有關其結構變化的信息。例如，Tuite等[59]研究了亞甲基藍與DNA作用的誘導CD譜，對亞甲基藍與不同堿基序列DNA結合的方式及序列選擇性進行了詳細的比較。Leng等[60]研究了道諾霉素與DNA作用前后產生的誘導CD譜的變化。

圖2 ctDNA的圓二色光譜

蛋白質的CD譜一般分為兩個波長范圍：185～245 nm為遠紫外區CD譜，245～320 nm為近紫外區CD譜。不同二級結構的蛋白質或多肽所產生CD譜帶的位置、吸收強弱都不相同。一般而言，遠紫外雙負峰(209 nm和222 nm左右的兩個負峰)是α-螺旋結構的典型譜形，其形狀與主鏈構象密切相關(圖3)[61]。β-折疊的CD譜在215 nm有一負峰，研究發現，β-折疊的CD譜與溶劑有較密切的關系，因此相應地,β-折疊的橢圓率值不如α-螺旋恒定，無規卷曲在198 nm的負峰并在220 nm附近有一個小而平寬的正峰。因此，根據所測得蛋白質或多肽的遠紫外CD譜，能反映出蛋白質或多肽鏈二級結構的信息。

圖3 多肽的圓二色光譜

3.7 拉曼光譜(Raman spectrum)

拉曼光譜是一種富含信息的分析技術，該方法可以分析作用前后不同基團振動譜帶的變化，從而判斷外源分子與DNA相互作用的結合機理及作用位點。其最大優點就是通用性好，因而不論在均相還是多相介質中都可以方便地應用，并有可能提供多相微環境對其它分子與DNA相互作用的影響。激光拉曼光譜能夠顯示血清白蛋白分子中肽鍵的特征性振動譜帶、主鏈骨架的振動譜帶以及側鏈的振動譜帶。因此，可以利用肽鍵的特征性振動譜帶作為指標來推斷血清白蛋白主鏈構象，Langlais等[62]借助拉曼光譜對一些金屬與ctDNA相互作用的構象變化、結合位點的研究表明，金屬離子濃度較低時，金屬離子與DNA上的磷酸基團結合，并導致聚核苷酸結構的微小變化。

3.8 紅外光譜(Fourier transform infra-red spectrum，FTIR)

傅立葉變換紅外光譜以及與之相應的傅立葉自卷積和二階導數譜的分析也可用于蛋白質二級結構的指認，從而成為一種新的研究生物大分子與小分子相互作用的手段[63～65]。蛋白質紅外光譜的酞氨I帶主要是其氨基酸殘基的C=O伸縮振動吸收，各種不同的二級結構與羰基和酰胺的氫之間形成的氫鍵有關。關于蛋白質酰胺I帶譜峰歸屬一般為：1650～1658 cm-1為α-螺旋；1610～1640 cm-1為β-折疊；1658～1695 cm-1為β-轉角；無規卷曲的吸收子帶在1657 cm-1左右。Tang等[27]采用熒光光譜、傅立葉變換紅外光譜聯合計算機模擬技術研究了滅鼠劑敵鼠與HSA的相互作用。結果表明，與敵鼠作用后，HSA的α-螺旋含量降低，β-轉角含量增加，而β-折疊幾乎沒有變化。

4 結語

隨著各種光譜技術不斷發展，新的理論及實驗技術不斷涌現，以及對SA及DNA立體結構的清晰了解，外源小分子與DNA、蛋白質相互作用的研究不斷深入，光譜技術在環境污染物與生物大分子相互作用的研究中發揮著更為重要的作用。

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