一株纖維素降解細菌的篩選、鑒定及特性研究

隨著現代工業的發展、世界人口的增長，化石能源對環境造成巨大危害，人類越來越意識到尋找清潔可再生能源的迫切性。來源于生物質原料的燃料乙醇以其可再生性、無污染性、不引起溫室效應等特點而被公認為最有工業應用前景的可再生能源之一，因而得到了廣泛的研究。

我國的纖維素資源非常豐富，僅農作物秸稈，每年就達6～10億t[1]。近年來， 對秸稈類纖維素物質的利用主要采用生物法， 即利用微生物將纖維素、半纖維素降解并轉化為菌體蛋白[2]，所以分離和篩選高效產酶的菌種顯得極其重要，但目前所篩選的高效纖維素降解菌多為真菌，生長較慢，且菌體產色，不適于工業應用。

作者在此篩選出一株可利用玉米種皮纖維作為底物、高效產纖維素酶的細菌，對擴大纖維素降解菌種的篩選和應用范圍具有重要意義。

1 實驗

1.1 材料與試劑

檸檬葉樣品：自然界采集，用生理鹽水清洗，風干后處理成小段，備用。

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液：稱取1 g CMC-Na，加入100 mL水，水浴加熱使溶解，再加入pH值5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液20 mL、水40 mL混勻，即得CMC-Na溶液。

DNS試劑參照文獻[3]配制。

1.2 培養基

1.2.1 CMC-Na篩選培養基[4]

CMC-Na 10.0 g，尿素 1.0 g，KH2PO42.0 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.5 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1000 mL，pH值為 5.0。

1.2.2 剛果紅分離篩選培養基[5，6]

KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂18.0 g，明膠2.0 g， CMC-Na 2.0 g，剛果紅0.20 g，蒸餾水1000 mL，pH值為5.0。

1.2.3 產酶培養基

玉米皮20 g，KH2PO42 g，CaCl20.5 g，吐溫-80 2 mL，CoCl20.5 mg，蒸餾水1000 mL，pH值為5.0。

1.3 方法

1.3.1 菌種初篩

將處理好的檸檬葉樣品放到CMC-Na篩選培養基平板上，于36℃培養48 h，觀察菌落形態。

1.3.2 菌種復篩

將劃線分離得到的單個菌株富集培養后分別點種到剛果紅分離篩選培養基平板上，于30℃培養3 d，觀察有無透明圈。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 菌種基因組DNA PCR模板的制備

取對數生長期的菌株1.5 mL，于13 000 r·min-1離心1 min，去上清，雙蒸水洗滌1次；再于13 000 r·min-1離心1 min，沉淀懸浮于200 μLTE緩沖溶液中， 沸水煮10 min；冰浴10 min，再于13 000 r·min-1離心5 min，將上清液儲存于-20℃，取1 μL用于PCR反應[7]。

1.3.3.2 PCR反應條件

PCR反應條件[4]：94℃ 5 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，32個循環；72℃ 8 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇理想的PCR產物送至北京索萊寶生物工程技術服務有限公司進行DNA測序。

1.4 葡萄糖標準曲線的繪制

用電子天平準確稱取0.250 g 葡萄糖，用蒸餾水溶解定容至250 mL，即得1.0 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。分別取上述標準溶液5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL于50 mL容量瓶中，稀釋定容；再分別取2 mL配制好的溶液，加入1.5 mL DNS試劑于沸水中加熱15 min顯色后，以蒸餾水作參比，在554 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標、葡萄糖濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程[3]。

1.5 酶活測定

取0.5 mL稀釋10倍的酶液，加入1.5 mL 0.625%羥甲基纖維素(CMC)溶液，于50℃保溫30 min，加入2 mL 10%的氫氧化鈉溶液終止反應，再加入3 mL DNS試劑，于沸水中煮15 min，在554 nm處測吸光度。根據標準曲線或線性回歸方程計算酶活[3]。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線(圖1)

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 透明圈與菌落形態(圖2)

圖2 透明圈照片(a)及菌落形態(b)

由圖2可以看出,在剛果紅-CMC培養基上的菌落周圍形成明顯的透明圈，證明菌落周圍的纖維素被降解。

2.3 菌種鑒定

根據16S rDNA序列比較推測細菌間進化關系，進而對未知細菌進行鑒定和檢測[1]。經NCBI上BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov) 同源性檢索和分析，發現菌株與Bacillussubtilis的16S rDNA序列有98%的同源性,因此初步確定其屬于枯草芽孢桿菌，命名為L13。

2.4 溫度對CMCase酶活的影響

在裝有100 mL產酶培養基的250 mL三角瓶中加入5%處在對數生長期的L13菌液，于pH值5.0、150 r·min-1條件下振蕩培養，每組3個平行，考察溫度對產酶的影響，結果如圖3所示。

圖3 溫度對CMCase酶活的影響

由圖3可以看出,菌株L13在50℃時產酶效果最好,CMCase 酶活最高達到4.02 U·mL-1。這可能是因為溫度過高或過低，均不利于酶的積累，從而影響產酶效果。

2.5 pH值對CMCase酶活的影響

在裝有100 mL產酶培養基的250 mL三角瓶中加入5%處在對數生長期的L13 菌液，于50℃、150 r·min-1條件下振蕩培養，每組3個平行，考察pH值對產酶的影響，結果如圖4所示。

圖4 pH值對CMCase 酶活的影響

由圖4可以看出,菌株L13在pH值5.0時產酶效果最好，CMCase酶活最高達到5.21 U·mL-1。這可能是因為，偏酸性的環境是菌種的適宜生長條件。

3 結論

(1)應用PCR擴增、16S rDNA測序及序列分析等技術，初步鑒定纖維素降解細菌為枯草芽孢桿菌。

(2)在50℃、pH值為5.0的條件下，菌株L13產酶效果最好，酶活最高達到5.21 U· mL-1。說明枯草芽孢桿菌對纖維素有較好降解能力，在處理農村大量秸稈和城市有機廢棄物方面有非常廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] 蔡燕飛，李華興，彭桂香，等.纖維素分解菌的篩選及鑒定[J].林產化學與工業，2005，25(2)：67-70.

[2] 李日強，王愛英，孔令冬.一株纖維素分解菌的分離選育[J].山西大學學報(自然科學版)，2006，29(3):317-320.

[3] QB 2583-2003，纖維素酶制劑[S].

[4] 安明泉.纖維素降解菌的篩選分離與產纖維素酶的特性研究[D]. 北京：中國石油大學(北京)，2008.

[5] 葉姜瑜.一種纖維素分解菌鑒別培養基[J ]. 微生物通報，1997，24(4)：251-252.

[6] Teather Ronald M,Wood Peter J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J]. Appl Environ Microbiol,1982，43(4)：777-780.

[7] 劉秋云，羅樨，何康澤，等.快速制備酵母質粒和基因組DNA PCR模板[J]. 微生物學通報，2001，28(5)：77-84.