新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元的研究

強心苷是一類對心臟具有顯著生物活性的甾體皂苷類化合物，具有增強心肌收縮力等作用，是臨床上用于治療心力衰竭等疾病的一線輔助藥物[1]。但由于其排泄緩慢、容易在體內(nèi)蓄積、治療劑量與中毒劑量非常接近等缺點，限制了其應用[2]。地高辛是一種臨床常用的強心苷類藥物，由異羥基洋地黃毒苷元在C3位連接三個洋地黃毒糖構成。

采用微生物轉化法對強心苷類藥物進行結構修飾已成為強心苷類藥物研究的熱點領域之一[3～6]。有文獻報道藍色犁頭霉(Absidiacoerulea)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ATCC 6476、米曲霉(Aspergilliusoryzae)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)ATCC 6227在洋地黃毒苷元的1β、5β、7β位點上具有羥基化能力。球毛殼霉菌(Chaetomiumglobosum)MN-211轉化洋地黃毒苷得到7β-羥基化產(chǎn)物；蠅卷霉(Circinellamuscae)MN-120轉化洋地黃毒苷得到12β-羥基化產(chǎn)物[6]。

新月彎孢霉(Curvularialunata)細胞內(nèi)含有P450酶系，被廣泛用于甾體化合物的羥基化過程[7，8]。異羥基洋地黃毒苷元在分子結構上與洋地黃毒苷元的結構相似。作者在此以地高辛和異羥基洋地黃毒苷元為底物，利用新月彎孢霉KA-91對其進行轉化，并對轉化工藝進行了初步優(yōu)化研究。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種

新月彎孢霉KA-91 ，天津科技大學微生物制藥研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)： 葡萄糖22，酵母膏4，牛肉膏5，pH值6.5。

1.1.3 藥品、試劑和儀器

地高辛(純度98%)，西安山川生物技術有限公司；異羥基洋地黃毒苷元(純度98%)，自制；氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇等均為市售分析純；甲醇為色譜純；薄層硅膠板GF254,德國默克公司。

HYG-Ⅱ型回旋式恒溫調速搖瓶柜；YJ-875S型醫(yī)用凈化臺；WS2-134-75型電熱恒溫培養(yǎng)箱；GB204型電子分析天平；Gilson型微量取樣器；三用紫外分析儀；Agilent1100型高效液相色譜分析儀；Bruker AV-600型核磁共振儀；傅立葉變換離子回旋共振質譜FT-ICR-MS。

1.2 方法

1.2.1 異羥基洋地黃毒苷元的制備

采用稀鹽酸水解地高辛制備異羥基洋地黃毒苷元。用含0.02 mol·L-1HCl的80%乙醇溶液水解20 mg·mL-1地高辛,水浴80℃回流酸解2～3 h[9]，用氯仿萃取，硅膠柱分離純化，得白色粉末,經(jīng)1HNMR、13CNMR和高分辨質譜檢測，鑒定其為異羥基洋地黃毒苷元。

1.2.2 菌體的培養(yǎng)

新月彎孢霉KA-91接種于斜面培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ脽o菌水洗下保藏斜面霉菌的孢子，制備濃度為3.0×106個·mL-1的孢子懸液。取1 mL孢子懸液接種到含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中， 于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 異羥基洋地黃毒苷元的生物轉化

菌體培養(yǎng)24 h后，分別加入用無水乙醇溶解配制的135 mmol·L-1地高辛溶液和135 mmol·L-1異羥基洋地黃毒苷元溶液，于28℃、180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止發(fā)酵。

1.2.4 產(chǎn)物的分離提取與純化

轉化結束后，抽濾，分離菌絲體和發(fā)酵液，分別用50 mL乙酸乙酯萃取菌絲體和發(fā)酵液3次，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮。采用硅膠色譜柱分離產(chǎn)物，洗脫劑為氯仿-甲醇(25∶1)。

1.3 分析與檢測

采用TLC薄層色譜法分析。展開劑為氯仿-甲醇-苯(10∶2∶5)，10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，其中異羥基洋地黃毒苷元的Rf值為0.325，產(chǎn)物的Rf值為0.388。

HPLC法檢測轉化率。在室溫下，流動相為甲醇-水( 55∶45)，流量為0.7 mL·min-1，檢測波長為220 nm。

產(chǎn)物純品的1HNMR和13CNMR采用Brucker AV-600 型核磁共振儀測定，以TMS為內(nèi)標，樣品溶解在C5D5N中。產(chǎn)物純品溶于甲醇中，用于FT-ICR-MS檢測。

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

新月彎孢霉KA-91對地高辛和異羥基洋地黃毒苷元的轉化結果表明，新月彎孢霉KA-91對地高辛不具有轉化能力，對異羥基洋地黃毒苷元具有轉化能力，經(jīng)結構鑒定轉化產(chǎn)物為3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元。

異羥基洋地黃毒苷元:白色粉末，不溶于氯仿，易溶于吡啶，分子式C23H34O5。FT-ICR-MS，m/z：413.2298 [M+ Na]+1。1HNMR(C5D5N)，δ：0.98(3H，S，Me-18)，1.23(3H，S，Me-19)，3.73( 1H，m，H-17)，4.3(1H，S，H-3)，5.25(1H， d，H-21a，J=18)，5.10(1H，d ，H-21b，J=18)，6.22(1H，S，H-22)。13CNMR(C5D5N)，δ：30.06(C-1)，28.20 (C-2)， 65.60 (C-3)，33.87 (C-4)，36.33 (C-5)，26.88 (C-6)，21.96 (C-7)，41.35 (C-8)，32.45 (C-9)，35.31 (C-10)，30.45 (C-11)，74.28 (C-12)，56.37 (C-13)，85.04 (C-14)，33.13 (C-15)，27.46 (C-16)，46.22 (C-17)，9.68 (C-18)，23.64 (C-19)，174.18 (C-20)，73.55 (C-21)，116.98 (C-22)，176.02 (C-23)。波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]一致。

3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元:白色粉末，不溶于氯仿，易溶于吡啶，分子式C23H32O5，F(xiàn)T-ICR-MS，m/z：411.2142 [M+ Na]+1。1HNMR(C5D5N),δ:0.88(3H，S，Me-18)，1.24(3H，S，Me-19)，3.74( 1H，m，H-17)，5.25(1H， d，H-21a，J=18)，5.11(1H，d ，H-21b，J=18)，6.23(1H，S，H-22)。13CNMR(C5D5N)，δ：36.97 (C-1)，37.27 (C-2)，211.19 (C-3)，42.41 (C-4)，43.97 (C-5)，27.06 (C-6)，21.91 (C-7)，41.58 (C-8)，33.57 (C-9)，35.37 (C-10)，30.80(C-11)，74.43 (C-12)，56.85 (C-13)，85.29 (C-14)，30.87 (C-15)，27.91 (C-16)，46.66(C-17)，10.15(C-18)，22.57(C-19)，174.63 (C-20)，74.02 (C-21)，117.58 (C-22)，176.32 (C-23)。波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]一致。

2.2 新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元反應

新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉化反應如圖1所示。

圖1 新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉化

由圖1可知，新月彎孢霉KA-91可以特定位點地氧化異羥基洋地黃毒苷元C3-OH轉為羰基，但不氧化C12-OH。

2.3 轉化條件的優(yōu)化

2.3.1 底物濃度對轉化的影響

新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元時，底物濃度對轉化率的影響見圖2。

圖2 底物濃度對轉化率的影響

由圖2可知，底物濃度在0.15～0.90 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，轉化率先上升再下降；在底物濃度為0.60 mmol·L-1時，轉化率達到最大值27.3%。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元的最適底物濃度為0.60 mmol·L-1。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值對轉化的影響(圖3)

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對轉化率的影響

由圖3可知，培養(yǎng)基初始pH值在5.0～8.0之間時，轉化率先上升再下降；在培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時，轉化率達到最大值38%。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元的最適pH值為6.0。

2.3.3 轉化溫度對轉化的影響(圖4)

由圖4可知，轉化溫度在28℃時轉化率最高。這是因為新月彎孢霉KA-91的適宜生長溫度為26～30℃，在28℃時酶的表達量最大，轉化率最高；溫度超過28℃后雖然生物量有所增加但酶的表達量反而下降。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元的最適轉化溫度為28℃。

圖4 轉化溫度對轉化率的影響

2.3.4 轉化過程曲線

新月彎孢霉在培養(yǎng)24 h后進入對數(shù)生長期[7]，此時，加入底物，考察新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉化過程，結果見圖5。

圖5 新月彎孢霉KA-91轉化生成3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元的過程曲線

由圖5可知，在轉化24～54 h過程中，隨著轉化時間的延長，轉化率相應上升；當轉化54 h時，轉化率最高達到40%；隨著轉化時間的繼續(xù)延長，菌體衰老，轉化率不再上升。因此，選擇新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的最適轉化時間為54 h。

3 結論

(1)新月彎孢霉KA-91對地高辛沒有轉化能力，對異羥基洋地黃毒苷元具有轉化能力，轉化產(chǎn)物通過1HNMR、13CNMR和傅立葉變換高分辨質譜分析，確定其為3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元。

(2)確定新月彎孢霉KA-91轉化異羥基洋地黃毒苷元的最優(yōu)工藝為：新月彎孢霉KA-91在28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基初始pH值為6.0，裝液量為50 mL·(250 mL)-1,加入底物的無水乙醇溶液(135 mmol·L-1)，使轉化液中異羥基洋地黃毒苷元初始濃度達到0.60 mmol·L-1，轉化54 h。此時，轉化率可達到40%。

參考文獻：

[1] 宋曉凱.天然藥物化學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2004：206-207.

[2] 尤中良.家庭慎用強心藥[J].醫(yī)藥與保健，2004，(9)：56-57.

[3] D?ller P C, Alfermann A W, Reinhard E. Biotransformation of cardenolides by cell suspension cultures ofDigitalislanataandThevetianeriifolia[J].Planta Med,1977,31(1):1-6.

[4] Alfermann A W, Schuller I， Reinhard E.Biotransformation of ca-rdiac glycosides by immobilized cells ofDigitalislanata[J].Planta Med,1980,40(2):218-223.

[5] Kreis W, Reinhard E.12β-Hydroxylation of digitoxin by suspension-culturedDigitalislanatacells: Production of digoxin in 20-litre and 300-litre air-lift bioreactors[J].J Biotechnol,1992,26(2-6):257-273.

[6] Pádua Rodrigo M, Oliveira Alaíde B, Souza Filho José D, et al. Biotransformation of digitoxigenin byFusariumciliatum[J]. J Braz Chem Soc, 2005,16(3B):614-619.

[7] 王敏,郭亞文,盧文玉,等.氫化可的松高轉化菌株的選育及其發(fā)酵條件[J].應用與環(huán)境生物學報,2004,10(5):663-666.

[8] 馮冰,馬百平,康利平,等.新月彎孢霉對重樓皂苷的生物轉化[J].中草藥,2005,36(7):978-983.

[9] 姚新生．天然藥物化學[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：321-327.