人脂肪組織來源干細胞生物學特性研究

朱 艷 霞，劉 天 慶＊， 宋 克 東， 姜 麗 麗， 馬 學 虎， 崔 占 峰

（1.大連理工大學 干細胞與組織工程研發中心，遼寧 大連 116024；2.牛津大學 工程科學系 組織工程與生物處理中心，英國 牛津 OX1 3PJ）

0 引 言

自2001年Zuk等[1]證實吸脂獲得的脂肪組織中存在具有多向分化潛能的細胞群，脂肪干細胞（adipose－derived stem cells，ADSC）逐漸被人們認識并進入干細胞研究領域.ADSC具有與骨髓間充質干細胞相似的生物學特性，并且脂肪組織分布廣泛、體內儲備量大，可以多次取材并且損傷小，因此，ADSC作為組織工程和再生治療的種子細胞前景十分廣闊.

目前國內外對ADSC體外增殖及定向誘導分化能力認識還存在分歧，研究者們通過不同方法獲得了不同量的脂肪干細胞[1、2]，要想獲得高質、高量的ADSC，必須建立一套更簡便有效的分離培養方法.另外，大多數研究顯示ADSC的增殖周期是6～7 d，然而有研究表明ADSC在增殖2周過程中，細胞的蛋白合成率和總蛋白量一直持續增加[3].因此，ADSC的生長特性還有待進一步闡明.

本實驗改進現有的ADSC體外分離培養方法，對其獲得率、體外增殖能力等進行研究，以期ADSC為種子細胞的細胞治療和組織構建提供細胞學基礎.

1 材料和方法

1.1 脂肪干細胞的分離培養

自外科手術患者（年齡16～60歲）皮下獲取正常脂肪組織，約500 mg，無鈣鎂 Hank′s液沖洗，用眼科剪盡量剪破脂肪組織中肉眼可見的細小血管，沖洗血液后剪碎脂肪組織，移入大玻璃管中，加入0.25%胰蛋白酶（sigma）和0.1%膠原酶（I型，sigma）（體積比1∶1），37℃恒溫搖床振蕩消化20 min.此時液面分為3層：上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個核細胞的液體.吸出下層液體移入含完全培養基（10%胎牛血清（hyclone）＋高糖 DMEM （gibco））的離心管中終止消化.在剩余脂肪中加入新的胰酶和膠原酶，重復以上步驟繼續消化，重復2～3次，將收集到的液體1500 r/min離心10 min，去除懸浮的脂肪細胞和脂滴，去上清，向細胞沉淀中加入含10%胎牛血清DMEM重懸細胞，移入培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱孵育，每2～3 d換液.細胞達到100%融合時，用0.25%胰酶和0.04%EDTA（體積比1∶1）消化傳代.

1.2 細胞形態學觀察

使用倒置顯微鏡（IX70－131，OLYMPUS）觀察細胞生長，并對傳代貼壁生長在培養瓶中的脂肪干細胞的生長、純化情況及增殖進行連續觀察、攝像.

1.3 細胞增殖動力學分析

將第4代ADSC以不同密度6.25×104、1.25×105、2.50×105、5.00×105、1.00×106和2.00×106cells/m L種于96孔板內，獲得細胞密度與光密度值的標準曲線.以5.00×103cells/m L的密度接種細胞并分別檢測和繪制第3、7和15代細胞的生長曲線.采用cck－8測量細胞增殖，每100μL培養液中加10μL無菌cck－8，孵育3 h后在酶聯免疫檢測儀上測各孔450 nm的光吸收值，參比波長630 nm.每組設置3個平行對照，實驗重復3次.

當細胞傳至20代時，分別將20代細胞按傳統的每5 d傳代1次（99%融合）和每14 d傳代1次（此時細胞重疊生長），兩種傳代方法傳代至25代時，分別繪制2個25代細胞的生長曲線.

1.4 累計群體倍增時間

根據生長曲線的指數增殖期計算群體倍增時間.群體倍增時間Td＝T×[lg 2/lg（Nt/N0）]，T代表生長曲線中的指數增殖時間段，N0是接種時的細胞數，Nt是指數增殖末期的細胞數.據此公式計算25代細胞的群體倍增時間Td.

1.5 細胞表面分子測定

取第4、20及2個25代細胞檢測其干細胞相關表面標記的表達，操作步驟如下：培養的脂肪干細胞經過消化離心（1000 r/min，5 min）后細胞重懸；細胞計數后將細胞濃度調整為1×107cells/m L，分 別 與 人 抗 CD13－PE、CD29－PE、CD34－FITC、CD44－FITC、CD45－FITC、CD105－FITC、CD166－PE 和 HLA－DR－PE作用20 min，PBS洗滌2次后用PBS重懸細胞，流式細胞儀（BD，San Jose，CA，USA）進行檢測.

1.6 逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT－PCR）

分別提取第4、20、30及2個25代細胞的總RNA，用合成第1鏈cDNA試劑盒（Ta KaRa，日本）逆轉錄合成cDNA、Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1的引物分別進行擴增，GAPDH作為參照.PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Scion Image圖像分析軟件對電泳條帶進行分析.

1.7 多向分化潛能的檢測

1.7.1 成脂肪誘導 取第4代及2個25代細胞，以1×105cells/m L的密度接種于24孔板中.當細胞貼壁生長達80%融合時，換成脂肪誘導試劑[1]，對照組加常規培養液.誘導14 d進行油紅染色以觀察細胞脂滴形成情況.

1.7.2 成骨誘導 當細胞貼壁生長達80%融合時，換成骨誘導試劑[1].細胞誘導培養1周時進行鈣鈷法堿性磷酸酶 （ALP）染色，3周進行Von Kossa染色，干燥后鏡下觀察.

1.7.3 成軟骨誘導 取第4代及2個25代細胞，調整細胞密度2×107cells/m L，取10μL滴于24孔板內，于37℃培養箱孵育3 h后加軟骨誘導劑[1].誘導培養2周后進行甲苯胺藍染色，干燥后顯微鏡下觀察.

1.7.4 成心肌誘導 取第4代及2個25代細胞，以1×105cells/m L的密度接種于24孔板中.當細胞貼壁生長達80%融合時加9μmol/L 5－氮胞苷，作用24 h后換新鮮培養基繼續培養4周.用心肌特異性連接蛋白Connexin－43進行免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下觀察.

1.8 統計學分析

采用SPSS 12.0軟件進行統計學處理，所有數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗.P＜0.05為有顯著性差異.

2 結 果

2.1 細胞形態

接種后ADSC在24 h內開始貼壁，初為短梭形，細胞大小不等，核漿比例較大.2～4 d可見細胞伸展，大多數細胞為長梭形，形態類似成纖維細胞，核橢圓形，較大（圖1（a））.原代培養的細胞3～4 d即達90%融合，傳代后第3代細胞生長出現方向性（圖1（b））；體外培養20代以后，細胞的增殖速度無明顯減慢，細胞形態無明顯改變（圖1（c））；30代以后的細胞體積明顯增大（圖1（d））.

2.2 細胞增殖動力學

在本文的培養條件下，ADSC可傳至30代以上.從圖2（b）可以看出在最初3 d ADSC處于生長適應期，第4 d開始細胞進入對數生長期，然而第8 d后細胞處于生長停滯期.但與其他研究結果不同的是細胞并未出現接觸抑制，而是繼續增殖到第10 d時達到又一個增殖峰值.接下來的幾天，細胞數量雖然有所減少，第12 d后細胞又進入另一個對數增殖期.從圖2還可以看出，隨著傳代次數的增加細胞的增殖能力有所下降.圖2（c）顯示了兩種傳代方法得到的第25代細胞的生長曲線.與圖2（b）類似，這兩種細胞的生長曲線表現出多個對數增殖期和增殖峰值，兩種方法得到的25代細胞都具有較強的增殖能力.

圖1 體外培養的脂肪干細胞形態學改變Fig.1 Morphology change of h ADSCs from subcutaneous fat tissue cultured in vitro

圖2 脂肪干細胞生長曲線Fig.2 Growth curves of h ADSC

顯微鏡下ADSC的形態學改變（圖3）與生長曲線一致.第6 d細胞達到90%融合，第10 d即出現局部重疊生長.然而第11 d，鏡下觀察到單層ADSC上有一些卷曲溶解的細胞，接下來的幾天，細胞繼續重疊生長，形成一個厚的細胞片層.20 d后，細胞片層從孔板邊緣卷起，細胞向卷起的空白區伸展增殖，跨過卷起的細胞片層和空白區.當細胞增殖至35 d以上，細胞片層完全卷起，此時通過cck－8檢測細胞數量，發現其OD值與20 d左右細胞的OD值無顯著性差異.

根據生長曲線計算細胞的群體倍增時間，發現細胞的群體倍增時間隨傳代次數的增加而增加，從第3代的36 h增加到第25代的96 h（圖4）.每代細胞幾個對數增殖期的倍增時間沒有顯著性差異，但第2個對數增殖期倍增時間稍短于其他對數增殖期的倍增時間.

圖3 對應于生長曲線不同時刻脂肪干細胞形態學改變Fig.3 Morphology changes of h ADSC in accordance with the growth curves

圖4 ADSC倍增時間的檢測Fig.4 Doubling time determination for ADSC

原代細胞增殖迅速，2～3 d細胞即達90%融合，隨著傳代純化，到第4代細胞得到完全純化時，ADSC細胞總量約為8×107個.根據細胞倍增時間計算可知每400～600 mg脂肪組織共可收獲約5×105個ADSC.

2.3 表面標志物的鑒定

流式細胞儀檢測結果發現（表1），第4、20、25代細胞中大多數細胞CD13、CD29、CD44、CD105和CD166陽性表達，而CD34、CD45和 HLA－DR都呈陰性表達.第4代細胞的陽性表達率稍高于第20代.本文還發現每隔14 d傳代得到的25代細胞干細胞相關表面標志的表達率要高于常規5 d傳代得到的25代細胞的表達率（P＜0.05）.

表1 第4和第20代脂肪干細胞表面CD標志物的表達Tab.1 Expression of cell surface CD markers of ADSCs of passages 4 and 20

2.4 轉錄因子的表達

第4和20代細胞轉錄因子Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1都呈陽性表達，兩者的表達率R沒有顯著性差異.第30代細胞 Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1 m RNA雖然也呈陽性表達，但表達率明顯低于其他兩代細胞（P＜0.05）（圖5（a）、6（a））.每14 d傳代得到的25代細胞Nanog、Oct－4、Sox－2和Rex－1的表達率明顯高于每5 d傳代得到的25代細胞的表達率（圖5（b）、6（b））.

表2 兩種傳代方法得到的25代細胞表面CD標志的表達Tab.2 Expression of cell surface CD markers of ADSC of passage 25 with two subculture methods

圖5 不同代數脂肪干細胞轉錄因子m RNA的表達情況Fig.5 Transcription factors mRNA expression in h ADSC of different passages

2.5 多向分化潛能

2.5.1 成脂肪潛能 ADSCs經脂肪誘導液向脂肪誘導分化5 d后，胞漿內出現少量脂滴并逐漸聚集.8 d后，細胞形態發生明顯改變，從長梭形類成纖維細胞外觀逐漸變圓，并且開始出現充滿脂滴的細胞.脂肪分化誘導2周后出現了大量的脂滴（圖7（a1））.油紅“O”染色后細胞內出現大量紅染顆粒（圖7（a2）、（a3）、（a4）），證明鏡下所見細胞內顆粒確為脂滴.另外，從半定量分析結果（圖8）可知，第25代細胞成脂肪能力明顯弱于第4代細胞.而2個25代細胞的成脂肪潛能沒有顯著性差異.

圖6 RT－PCR結果半定量分析Fig.6 Semiquantitative RT－PCR analysis

2.5.2 成骨潛能ADSCs 成骨誘導后約7 d長滿單層，生長略慢.細胞多為梭形，隨時間延長，密度增高，細胞呈多層生長，細胞外分泌基質增多.經ALP染色后見第4代細胞具有較強的堿性磷酸酶的活性（圖7（b2）），而第25代細胞誘導7 d后堿性磷酸酶的活性明顯低于第4代（圖7（b3）、7（b4））.14 d時有局灶型點狀鈣化斑形成，21 d時形成明顯的礦化結節沉積，隨誘導時間增加，結節狀沉積愈加明顯，顏色加深.Von Kossa染色顯示結節狀沉積為黑色（圖7（c2）、（c3）、（c4）），證實了結節狀沉積為鈣鹽沉積.同樣，第25代細胞形成的鈣化結節明顯少于第4代細胞.2個25代細胞堿性磷酸酶活性和鈣化結節形成都沒有顯著性差異（圖8）.

圖7 脂肪干細胞多向分化潛能的檢測Fig.7 Multi－differentiation potentials of h ADSCs toward mesodermal and endodermal lineages

2.5.3 成軟骨潛能 經軟骨誘導液培養后，細胞體積增大，生長相對變慢，細胞由成纖維樣變為橢圓形及三角形，有的呈腎形（圖7（d1））.誘導培養14 d可見細胞周圍有基質分泌.甲苯胺藍染色后，可見大量異染性基質，呈藍紫色（圖7（d2）、（d3）、（d4）），表現為軟骨細胞分化特點（見圖4）.2個25代細胞成軟骨潛能沒有顯著性差異，但都明顯低于第4代細胞.

2.5.4 成心肌潛能 5－氮胞苷作用24 h，繼續培養4周后細胞重疊生長，但并沒有發現明顯的形態學改變和自發搏動的細胞.熒光染色后顯微鏡下觀察，第4代ADSC少有的幾個細胞出現綠色熒光（圖7（e2）），而第25代細胞誘導染色后未見綠色熒光（圖7（e3）、（e4））.

圖8 脂肪干細胞分化率的半定量分析Fig.8 Semiquantitative analysis of differentiation ratio of ADSCs

3 討 論

用本文改進的分離方法，每500 mg脂肪組織平均可獲得5×105個干細胞，比文獻報道的細胞獲得率[4]高20倍以上.這是因為本文應用胰酶和膠原酶聯合消化，可大大縮短消化時間，從而避免了酶對細胞的過度損傷.此外，為排除紅細胞的干擾，一般都使用NH4Cl破壞紅細胞[5]，而本文是通過換液的方法去除紅細胞，2次換液后紅細胞基本消失，這樣就避免了NH4Cl對細胞的損傷.

本文分離培養的ADSC比前人的具有更強的增殖能力，25 d內出現3個對數增殖期，雖然在每個對數增殖期末有生長停滯現象，鏡下可觀察到細胞出現接觸抑制，有少量細胞死亡，但通過反饋作用細胞又繼續分裂增殖，進入另一個增殖高峰.ADSC 如此強的增殖能力是以前報道[6、7]中從未出現過的.

雖然體外長期傳代培養后ADSC仍能保持較強的增殖能力，但還是隨著傳代次數的增加有所下降，表明傳代時胰酶的作用會對細胞造成一定的損傷.為減少胰酶的作用次數，本文將培養至20代的細胞分別按常規5 d傳代，或14 d傳代，傳至25代時發現每14 d傳代得到的細胞增殖力略高于每5 d傳代得到的細胞，并且細胞數量是常規傳代的20倍.

本文所培養的ADSC其CD34和CD45都呈陰性表達，HLA－DR作為排除成纖維細胞的表面標志也是持續陰性表達，這可以為ADSC的自體或同種異體移植提供理論依據.同時CD13、CD29、CD44、CD105和CD166都呈陽性表達，與其他研究結果一致[2、8].間充質標志物持續表達說明貼壁的ADSC可以增殖而沒有丟失干細胞相關的表面標志物，反映了ADSC向間充質起源細胞系的分化能力，如脂肪、軟骨和成骨.

轉錄因子 Nanog、Oct－4、Sox－2和 Rex－1，特別是Oct－4、Nanog和Sox－2在指導干細胞的多向分化潛能中起著重要的作用[9].本文培養的ADSC傳至30代時仍能表達 Oct－4、Nanog、Sox－2和Rex－1 mRNA，而且每隔14 d傳代得到的25代細胞的表達率高于每隔5 d傳代得到的細胞.因為這4個轉錄因子啟動、維持并調節多能干細胞的分化潛能[10]，因此每隔14 d傳代得到的細胞與常規傳代的細胞相比具有更強的分化潛能.

4 結 語

本研究方法可以從500 mg人脂肪組織中獲得5×105個干細胞，而且所分離的細胞可快速長期持續增殖（3～4 d即可達到95%融合，1個月出現3個對數增殖期）；增殖至25代以上仍能較好保持干細胞表型特征和多向分化潛能；如果每隔14 d傳代而非常規5 d傳代，可獲得更多更高質量的干細胞.因此ADSC相對于MSC是一個更好的干細胞資源，在細胞移植和組織工程中將有很好的應用前景.

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