吳茱萸次堿的合成、結(jié)構(gòu)表征及體內(nèi)抗腫瘤作用研究

癌癥是威脅人類生命最嚴(yán)重的疾病之一。中藥抗腫瘤藥物的研究是在20世紀(jì)上半葉逐步形成和發(fā)展的，在惡性腫瘤引起死亡率呈上升趨勢(shì)的今天，開發(fā)療效顯著、不良反應(yīng)小的抗腫瘤新藥具有重要意義，其中中藥抗腫瘤新藥具有廣闊的前景[1]。

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)。味苦辛、性溫?zé)帷⒂行《?，具有散寒止痛、降逆止吐、助陽止瀉之功效，用于厥陰頭痛、腹脘冷痛、嘔吐泄瀉、痛經(jīng)、高血壓等癥[2]。吳茱萸含有多種生物堿、揮發(fā)油、苦味素等化學(xué)成分[3,4]，其有效活性成分吳茱萸次堿(Rutaecarpine)屬于喹唑啉酮咔啉生物堿，具有良好的強(qiáng)心、降壓、舒血管、利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、降低血小板凝聚、松弛血管平滑肌及肛門括約肌等作用[5～9]。近年來，國(guó)內(nèi)外已有一些吳茱萸次堿抗腫瘤作用的報(bào)道[10～12]，但是到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn)主要集中于吳茱萸提取物的抗腫瘤活性，而對(duì)吳茱萸的有效單體化合物的合成及抗腫瘤活性研究很少，并且由于從吳茱萸中提取的有效成分含量很低，難于進(jìn)行深入的研究。

作者以色胺和靛紅酸酐為起始原料經(jīng)三步反應(yīng)合成吳茱萸次堿，通過元素分析、IR、質(zhì)譜、1HNMR等對(duì)合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了表征。并考察了吳茱萸次堿對(duì)小鼠移植性肉瘤S180和肝癌H22的作用情況。吳茱萸次堿(化合物Ⅰ)的合成路線如下：

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

色胺(98%)，J&K Chemical Ltd.；三氟乙酸酐(99%)、靛紅酸酐(98%)，New Jersey USA:1-800-ACROS-01；注射用環(huán)磷酰胺(Cytoxan，CTX)，山西普德藥業(yè)有限公司；其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

WRS-1A型數(shù)字熔點(diǎn)儀，上海物理光學(xué)儀器廠；Vario EL-Ⅲ型元素分析儀，德國(guó)；EQUINOX55型紅外光譜儀(KBr壓片)，德國(guó)Bruker公司；VARIAN INOVA 400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀，美國(guó)Varian公司；AXIMA-CFRTMplus型基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行質(zhì)譜儀，英國(guó)克雷斯托公司；Motic AE21型倒置顯微鏡；100級(jí)超凈工作室，蘇州；離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株

昆明種小鼠[合格證號(hào)：SCXK(陜)2007-001]，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠S180肉瘤細(xì)胞、小鼠H22腹水型肝癌細(xì)胞，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 吳茱萸次堿的合成

1.3.1 化合物Ⅳ的合成

在裝有回流冷凝管、溫度計(jì)、滴液漏斗和磁子的三頸瓶中加入1.63 g(0.01 mol)靛紅酸酐(化合物Ⅱ)和20 mL吡啶(干燥)，常溫下滴加1.5 mL(0.01 mol)三氟乙酸酐和5 mL吡啶的混合溶液。攪拌1 h后，146℃加熱回流1.5 h。然后滴加1.6 g(0.01 mol)色胺(化合物Ⅲ)和5 mL吡啶混合溶液，滴加完后回流1.5 h。冷卻,倒入50 mL冰水中，靜置50 h,析出灰白色沉淀。過濾，用少量氯仿洗滌3次，干燥，得到白色固體2.08 g。m.p.176～178℃(文獻(xiàn)[13]值：178～180℃)。

1.3.2 化合物Ⅴ的合成

在裝有回流冷凝管、溫度計(jì)和磁子的三頸瓶中加入1.78 g(0.005 mol)化合物Ⅳ、10 mL乙酸和2 mL鹽酸，加熱攪拌回流1.5 h。冷卻，加入50 mL冰水，靜置24 h，析出灰色沉淀。過濾，用少量乙醇洗滌3次，干燥，得到白色粉末狀晶體1.3 g。m.p.268～269℃(文獻(xiàn)[14]值：270℃)。

1.3.3 吳茱萸次堿的合成

在裝有回流冷凝管、溫度計(jì)和磁子的三頸瓶中加入0.5 g NaOH和3 mL水，攪拌至NaOH溶解后，加入8 mL乙醇，加熱攪拌，慢慢加入1.07 g(0.003 mol)化合物Ⅴ，130℃回流1.5 h，冷卻,倒入100 mL冰水中，靜置48 h,析出灰褐色沉淀。過濾，用10 mL氯仿和甲醇的混合溶劑(1∶1)重結(jié)晶，得到淺黃色固體0.62 g。m.p.260～262℃(文獻(xiàn)[15]值：258～259℃)。

1.4 抑瘤實(shí)驗(yàn)[16,17]

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組：陰性對(duì)照組(蒸餾水20 mL·kg-1)，陽性CTX組(20 mg·kg-1)，吳茱萸次堿高、中、低劑量組(20 mg·kg-1、10 mg·kg-1和5 mg·kg-1)。選取移植腫瘤7 d、腫瘤生長(zhǎng)良好、腹部膨隆明顯的小鼠，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，進(jìn)行腹部皮膚消毒。用一次性無菌采血器經(jīng)腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入無菌試管中，從中抽取0.1 mL以生理鹽水稀釋50倍，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)·mL-1。于每只實(shí)驗(yàn)小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2 mL。各組動(dòng)物于接種腫瘤次日隨機(jī)分組(H22每組10只，S180每組12只)并開始灌胃給藥。每日1次，連續(xù)給藥10 d。給藥結(jié)束次日，將動(dòng)物稱重后脫頸椎處死，剝離出皮下瘤塊，并取出脾臟和胸腺，稱重，比較各組間腫瘤質(zhì)量的差異性。按照下列公式計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟平均質(zhì)量(mg)/小鼠平均質(zhì)量(g)

胸腺指數(shù)=胸腺平均質(zhì)量(mg)/小鼠平均質(zhì)量(g)

2 結(jié)果與討論

2.1 元素分析(表1)

表1 中間化合物和吳茱萸次堿的顏色及元素分析

由表1可見，各化合物的元素分析實(shí)測(cè)值和理論值基本相符。

2.2 紅外光譜分析

以KBr為基質(zhì)，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定吳茱萸次堿的紅外光譜,見圖1。

圖1 吳茱萸次堿的紅外光譜圖

由圖1可見，吳茱萸次堿在3339 cm-1處出現(xiàn)N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1655 cm-1處出現(xiàn)C=O的特征吸收峰，在1545 cm-1處出現(xiàn)C=N的特征吸收峰，在1598 cm-1、1461 cm-1、731 cm-1出現(xiàn)苯環(huán)的特征吸收峰，與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的一致，說明已成功合成目標(biāo)化合物。

2.3 質(zhì)譜及核磁共振氫譜分析

吳茱萸次堿的質(zhì)譜圖(CDCl3為溶劑)和1HNMR(CDCl3為溶劑)譜圖見圖2和3。

圖2 吳茱萸次堿的質(zhì)譜圖

由圖3可見，吳茱萸次堿的1HNMR圖譜中存在6種不同環(huán)境的氫，分別歸屬為：11.87(s,1H,N-H)，8.31(d,1H)，7.79(t,1H)，7.65(d,1H)，7.52(d,1H)，7.41(t,1H)，7.26(t,1H)，7.10(t,1H)，4.59(t,2H)，3.25(t,2H)，這與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的一致。且質(zhì)譜最高強(qiáng)度峰為吳茱萸次堿的分子量，進(jìn)一步證實(shí)已成功合成目標(biāo)化合物。

圖3 吳茱萸次堿的1HNMR譜圖

2.4 抗腫瘤活性

2.4.1 吳茱萸次堿對(duì)移植S180小鼠的影響(表2)

表2 吳茱萸次堿對(duì)移植S180小鼠的影響

由表2可見,與陰性對(duì)照組比較，吳茱萸次堿高、中、低劑量給藥組瘤體質(zhì)量都有所降低，平均抑瘤率分別為42.83%、41.05%、37.55%。說明吳茱萸次堿對(duì)瘤體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。但吳茱萸次堿給藥組的平均抑瘤率低于陽性CTX組，說明吳茱萸次堿對(duì)S180移植瘤瘤體生長(zhǎng)的抑制作用不如環(huán)磷酰胺。陽性CTX組與陰性對(duì)照組相比，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有所降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明環(huán)磷酰胺有損傷免疫器官的作用。而吳茱萸次堿各給藥組能明顯增加小鼠脾臟指數(shù)(P<0.05)，對(duì)胸腺指數(shù)影響不明顯，提示吳茱萸次堿能夠保護(hù)免疫器官，增強(qiáng)免疫力。

2.4.2 吳茱萸次堿對(duì)移植H22小鼠的影響(表3)

表3 吳茱萸次堿對(duì)移植H22小鼠的影響

由表3可見,與陰性對(duì)照組比較，吳茱萸次堿高、中、低劑量給藥組瘤體質(zhì)量都有所降低(P<0.05),平均抑瘤率分別為43.83%、43.53%、35.03%。說明吳茱萸次堿對(duì)瘤體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。但吳茱萸次堿給藥組的平均抑瘤率低于陽性CTX組，說明吳茱萸次堿對(duì)H22移植瘤瘤體生長(zhǎng)的抑制作用不如環(huán)磷酰胺。而陽性CTX組與陰性對(duì)照組相比，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)有所降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明環(huán)磷酰胺有損傷免疫器官的作用。而吳茱萸次堿作用移植H22小鼠后，脾臟指數(shù)略有下降，雖然對(duì)免疫器官有損傷，但比環(huán)磷酰胺的損傷作用小。

3 結(jié)論

吳茱萸是一種藥效明確的天然植物，吳茱萸次堿作為其主要活性成分，對(duì)小鼠移植性腫瘤S180和H22瘤體生長(zhǎng)均具有抑制作用，且它們作用腫瘤小鼠后對(duì)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)影響較小，甚至有增加作用。因此，吳茱萸次堿是吳茱萸抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為抗腫瘤藥物具有極大的開發(fā)潛力。

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