L-精氨酸助溶菌酶復性過程動力學研究

隨著基因工程領域的研究和發展，外源蛋白在大腸桿菌(E.coli)內的克隆與表達已不再困難，通過細胞培養大量生產對人類有重要價值的蛋白質已成為可能。重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，無論是原核表達體系，還是真核表達體系甚至高等真核表達體系，都容易形成沒有生物活性的包涵體，這主要是因為在重組蛋白的大量表達過程中，缺乏某些蛋白質正確折疊所需要的酶和分子伴侶等，或因環境不適無法形成正確的次級鍵等[1]。從包涵體中獲得有活性的蛋白，必須進行體外復性。蛋白質復性技術對于重組蛋白的大規模生產具有重要意義，其中稀釋復性是一種最常見的蛋白質復性方法。

實現蛋白質復性首先需要提供能使蛋白質以能量最低狀態存在的溶液環境，其次在操作過程中需抑制蛋白質聚集體的生成[2]。蛋白質折疊過程中存在兩種疏水作用，即分子內和分子間疏水作用。前者促進蛋白質正確折疊成天然活性態，而后者導致變性蛋白質發生不可逆聚集和沉淀[3]。稀釋復性過程中往往由于聚集體的生成而嚴重影響復性收率。抑制蛋白質肽鏈之間的聚集作用、提高變性蛋白質的復性收率成為當前蛋白質復性研究的焦點。為了抑制變性蛋白質分子間的疏水作用、提高蛋白質復性收率，體外復性時添加輔助因子是其有效方法之一[4]。

L-精氨酸(L-Arginine，簡稱L-Arg)具有成本低廉、性質穩定等優點，對某些蛋白質的復性有很好的促進作用[5，6]，特別是對一些含二硫鍵的變性蛋白[7]或某些重組蛋白的體外復性[8，9]，添加L-精氨酸能很好地提高其蛋白復性收率[7]。但是，L-精氨酸促進蛋白質復性過程特性的分析和研究很少[6，7，10]，特別是未見其復性過程動力學模型的研究報道。

作者利用變性蛋白質復性研究中提出的復性和聚集競爭反應機制[11]，以溶菌酶為模型蛋白，研究了L-精氨酸助溶菌酶復性的最佳條件和表觀動力學，并討論L-精氨酸助復性的可能機理，為下一步基因工程重組蛋白的復性研究打下基礎。

1 實驗

1.1 試劑

溶菌酶，碘乙酸 (Sigma,USA),二硫蘇糖醇(DTT)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，還原型谷胱甘肽(GSH)，L-精氨酸，三羥基氨基甲烷(Tris)，尿素(進口分裝，上海源聚生物科技有限公司)。

變性緩沖溶液為pH值8.6的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含8 mol·L-1尿素、30 mmol·L-1DTT和1 mmol·L-1EDTA。

基礎復性緩沖溶液為pH值8.2的0.1 mol·L-1Tris-HCl,含0.4 mmol·L-1GSSG、4 mmol·L-1GSH和1.0 mmol·L-1EDTA。用該緩沖溶液配制不同濃度的L-Arg復性緩沖溶液，備用。

1.2 方法

1.2.1 溶菌酶的變性

稱取天然溶菌酶固體溶解于變性緩沖溶液中，濃度為10 mg·mL-1,在37℃下保溫4 h使溶菌酶徹底變性，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 溶菌酶的復性

取一定量的變性溶菌酶與復性緩沖溶液混合至總體積為3 mL，在37℃下保溫24 h，測定酶活性。

1.2.3 復性動力學測定

取所需的變性溶菌酶原液置于250 mL錐形瓶，加入所需的復性緩沖溶液至總體積為100 mL,混合后置于恒溫水浴搖床(37℃、60 r·min-1)進行復性。復性過程中定時取樣，每次取樣量為1 mL,加入100 μL 0.5 mol·L-1碘乙酸作為反應終止劑。實驗結束后統一測定樣品活性。

1.2.4 溶菌酶活性測定[11]

以微球菌(Micrococcuoslysodeikticus)為底物，用pH值6.2的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液配制微球菌溶液，調節其在450 nm處的吸光度為1.3，然后取2.5 mL菌液，加入500 μL溶菌酶溶液，測定反應液在450 nm處吸光度的變化，通過吸光度的降低速率來計算溶菌酶的活性。

用復性收率(Yield)表征復性效果。

2 結果與討論

2.1 L-Arg助溶菌酶復性的最佳條件

2.1.1 溶菌酶濃度的選擇

稀釋復性過程中的聚集反應是導致復性收率低的首要原因，為減少聚集并促進折疊反應和提高復性收率，通常將蛋白質稀釋到很低的濃度(10～50 μg·mL-1)[8]，但同時也限制了它的大規模應用。如復性過程中添加L-Arg，溶菌酶可以在100～500 μg·mL-1濃度范圍內保持較高的復性收率。

在復性緩沖溶液中分別添加0 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.6 mol·L-1和0.8 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度對溶菌酶復性收率的影響見圖1。

圖1 溶菌酶濃度對溶菌酶復性收率的影響

從圖1可以看出，隨著溶菌酶濃度的增大，溶菌酶復性收率呈下降趨勢；加入L-Arg后，復性收率明顯提高。同時，添加L-Arg后，溶菌酶濃度從100 μg·mL-1升至200 μg·mL-1時，復性收率略有下降；但溶菌酶濃度升至250 μg·mL-1后，復性收率急劇下降。在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1時，添加0.8 mol·L-1L-Arg時，復性收率可達80%以上；添加0.6 mol·L-1L-Arg時，復性收率也可達80%；當溶菌酶濃度超過300 μg·mL-1時，復性收率均低于50%。因此，確定最佳溶菌酶濃度為200～300 μg·mL-1。

2.1.2 L-Arg濃度的選擇

實驗發現，不添加L-Arg，溶菌酶濃度即使為100 μg·mL-1，復性體系也會出現大量沉淀，復性收率也很低(低于50%)；添加0.4 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度為200 μg·mL-1開始出現沉淀；添加0.6 mol·L-1L-Arg，溶菌酶濃度為300 μg·mL-1開始出現沉淀；添加0.8 mol·L-1L-Arg,溶菌酶濃度為500 μg·mL-1時，復性體系也沒有出現沉淀。可見添加L-Arg可以在一定程度上抑制復性過程中蛋白聚集。

L-Arg濃度對溶菌酶復性收率的影響見圖2。

圖2 L-Arg濃度對溶菌酶復性收率的影響

從圖2可以看出，隨著L-Arg濃度的增大，復性收率先升高后降低，當L-Arg濃度為0.8 mol·L-1時，復性收率最高。因此，確定L-Arg的最佳濃度為0.8 mol·L-1。

2.2 L-Arg助溶菌酶復性過程動力學研究

2.2.1 動力學模型

變性蛋白質的復性動力學通常采用基礎三態模型描述，即：

其中：U為變性蛋白；I為中間態蛋白；N為天然態蛋白；A為聚集態蛋白。對變性溶菌酶，由U生成I的過程為快速反應過程，在10～200 ms內完成[11]，故基礎三態模型描述的復性反應可進一步簡化為從I生成N和A的平行反應。復性動力學方程為：

(1)

(2)

初始條件為：

t=0，cI=cU,0

(3)

式中:kN為復性速率常數；kA為聚集體生成速率常數；n為聚集體生成反應級數；cI為中間態蛋白濃度；cU,0為變性蛋白的初始濃度;cN為天然態蛋白濃度。

Maachupalli-Reddy等[11]在對變性溶菌酶的稀釋復性研究中發現，在溶菌酶濃度為0.1～0.6 mg·mL-1范圍內，聚集體的生成符合三級反應動力學，即n=3。因此，積分式(1)～(3),得到：

(4)

其中：

(5)

(6)

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1、復性溶液pH值為8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg條件下，研究溶菌酶的復性動力學，結果見圖3。

圖3 L-Arg助溶菌酶復性動力學曲線

實驗數據與式(4)可以較好地擬合，這也與Maachupalli-Reddy等[11]的報道結果一致。擬合得到的速率常數kN=0.0345 min-1、kA=0.265 mL2·mg-2·min-1。與文獻[11]報道的速率常數(kN=0.045 min-1、kA=0.728 mL2·mg-2·min-1)對比，添加0.8 mol·L-1L-Arg得到的復性速率常數kN略有減小，但聚集體生成速率常數kA卻降低60%多。這也說明添加L-Arg有明顯抑制復性蛋白聚集沉淀的作用。

2.2.2 溶菌酶濃度對復性動力學的影響

在復性溶液pH 值為8.2、添加0.8 mol· L-1L-Arg條件下，考察溶菌酶濃度對復性動力學的影響，結果見圖4。

圖4 添加0.8 mol·L-1L-Arg時，溶菌酶濃度對復性動力學的影響

實驗表明，溶菌酶濃度在100～500 μg·mL-1時，添加0.8 mol· L-1L-Arg助溶菌酶復性，其復性動力學實驗數據也與式(4)較好地擬合。

在復性溶液pH值為8.2、添加 0.8 mol· L-1L-Arg條件下，溶菌酶復性速率常數kN、聚集體生成速率常數kA及復性收率Yield見表1。

從表1可以看出，在其它復性條件相同的情況下，隨著溶菌酶濃度的增大，復性速率常數kN不斷下降、蛋白復性收率也不斷下降、聚集體生成速率常數kA逐步增大。這意味著隨著溶菌酶濃度的增大，復性速率是逐漸降低的，即在復性的初始階段中間態蛋白生成天然態蛋白的反應速度下降，造成過多的中間態蛋白生成聚集態蛋白，使得聚集體生成速率常數kA增大，聚集態蛋白量相應增大，復性收率也就下降。由此可見，要保持高的復性收率，溶菌酶濃度不能太高，最好不要超過300 μg·mL-1，這也與2.1.1的結果相一致。

表1 溶菌酶濃度對0.8 mol·L-1 L-Arg助溶菌酶復性的 復性速率常數、聚集體生成速率常數、復性收率的影響

2.2.3 L-Arg濃度對復性動力學的影響

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1的條件下，考察L-Arg濃度對復性動力學的影響，結果見圖5。

圖5 L-Arg濃度對溶菌酶復性動力學的影響

實驗表明，溶菌酶濃度為200 μg·mL-1時，添加0～1.0 mol·L-1L-Arg助溶菌酶復性，其復性動力學實驗數據也與式(4)能較好地擬合。

在溶菌酶濃度為200 μg·mL-1條件下添加不同濃度L-Arg,溶菌酶復性速率常數kN、聚集體生成速率常數kA及復性收率Yield見表2。

表2 L-Arg濃度對溶菌酶復性的復性速率常數、聚集體生成速率常數、復性收率的影響

從表2可以看出,在溶菌酶濃度不變的情況下,隨著L-Arg濃度的增大,溶菌酶復性速率常數kN變化不大,但聚集體生成速率常數kA卻顯著減小。這說明L-Arg的作用主要是抑制蛋白聚集沉淀，而且L-Arg對蛋白聚集體的抑制作用隨著其濃度的增大而不斷增強。同時，隨著L-Arg濃度的增加，溶菌酶復性速率常數kN先是不斷增加，在0.6～0.8 mol·L-1L-Arg范圍內相對較高，繼續增加L-Arg濃度，復性速率常數kN卻不增反降。這表明L-Arg既可以抑制蛋白分子之間的疏水作用，又可以抑制分子內的疏水相互作用，前者抑制蛋白聚集沉淀，后者卻抑制蛋白復性，在添加L-Arg濃度低于0.8 mol·L-1時，L-Arg對蛋白分子間疏水作用力的抑制作用強于對分子內疏水作用力，表現為聚集體生成速率常數kA的降低和溶菌酶復性速率常數kN的上升，且kA的降低幅度遠大于kN的上升幅度，復性收率Yield不斷上升；而L-Arg濃度高于0.8 mol·L-1時，對蛋白分子間疏水作用力的抑制作用卻弱于對分子內疏水作用力，表現為kA和kN均降低，但kN降低幅度更大，復性收率Yield下降。因此，添加L-Arg助溶菌酶復性，L-Arg的最適濃度為0.8 mol·L-1，這與2.1.2結果相一致。

3 結論

利用L-Arg助溶菌酶復性時，其最佳的復性條件如下：溶菌酶濃度為200～300 μg·mL-1，添加的L-Arg濃度為0.8 mol·L-1。蛋白質的復性和聚集反應競爭三態動力學模型能較好地描述L-Arg助溶菌酶復性過程。利用該模型分析溶菌酶濃度和添加的L-Arg濃度對復性速率常數kN、聚集體生成速率常數kA以及復性收率Yield的影響，獲得了有價值的結果。添加L-Arg助蛋白復性，L-Arg主要是通過抑制蛋白分子間的疏水作用來抑制復性過程蛋白聚集沉淀，從而達到提高復性收率的效果。

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