原生質體融合技術提高微生物絮凝劑處理含油廢水效果的研究

絮凝法是處理含油廢水的一種常用方法，在廢水處理中占有十分重要的地位[1]。絮凝劑按其來源及性質可分為無機絮凝劑、有機高分子絮凝劑和微生物絮凝劑[2]，其中微生物絮凝劑具有高效、安全無毒、無二次污染、易于生物降解等特點[3]。開發高效微生物絮凝劑，既能明顯提高絮凝效果，還可以大大降低絮凝劑投入量，從而降低處理成本[4]。

原生質體融合技術廣泛應用于各類微生物遺傳育種[5，6]，主要包括：原生質體的制備與再生、親本的遺傳標記、原生質體融合及融合重組體的檢出與分離[7]。

作者在此將絮凝劑產生菌與一株石油降解菌進行原生質體融合構建高效產絮凝劑的細胞工程菌，并對其發酵條件進行了優化，將其用于含油廢水處理，對其絮凝活性進行了研究。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

微生物絮凝劑產生菌B-6-1和石油降解菌SJ-1，自行保存。

液體發酵培養基(g)：蔗糖 20， 尿素 0.75，酵母膏0.75，磷酸氫二鉀5， 磷酸二氫鉀5,氯化鈉0.1，去離子水1000 mL， pH值7.0。

1.2 試劑與儀器

SMM溶液(mol·L-1)：蔗糖0.5，順丁烯二酸0.02，MgCl2·6H2O 0.02，pH 值6.5。

除酵母膏為生化試劑外，其余試劑均為分析純。

TS-100型相差顯微鏡，日本尼康公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗設備有限公司；HZQ-X100型振蕩培養箱，哈爾濱東聯電子技術開發公司；OIL510型全自動紅外分光測油儀，北京華夏科創儀器技術有限公司；HH-6型化學耗氧量測定儀，江蘇江分電分析儀器有限公司；DBJ-623型電子變速攪拌機，解放軍四三三二工廠；PH510型臺式酸度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 含油廢水的配制

在1000 mL自來水中加入0.15 g硫酸亞鐵、0.1 g硝酸鈉、0.05 g硫酸鎂、 0.1 g氯化銨、0.2 g煤灰塵、0.08 g原油，pH值自然。

1.4 原生質體的制備和再生

將微生物絮凝劑產生菌B-6-1和石油降解菌SJ-1培養至對數中期，移取5 mL菌液，6000 r·min-1離心10 min，棄上清。用SMM溶液洗滌菌體2次,6000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀懸浮于10 mL SMM溶液中，充分振蕩打散菌體。移取菌懸液到離心管中，加入溶菌酶酶解，并不時振蕩。當大部分菌體形態為球形時，停止酶解。取酶解過的原生質體液，6000 r·min-1離心10 min，棄上清，再用SMM溶液洗滌2次，將沉淀懸浮，充分振蕩打散，4℃下保存，備用。

1.5 原生質體的融合及篩選

60℃恒溫水浴處理微生物絮凝劑產生菌B-6-1 70 min，于15 W紫外燈下處理石油降解菌SJ-1 20 min。取滅活后的兩親本原生質體懸浮液各0.5 mL混勻，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入1 mL 40% PEG6000，37℃下處理15 min，立即用SMM溶液稀釋，離心棄上清，再用SMM溶液定容至1 mL，混勻后，涂SMM再生平板，37℃恒溫培養3～4 d。

融合子接入到發酵培養基和原油平板中，培養一段時間后，觀察發酵液的粘稠度和原油平板中菌株生長情況。對發酵液粘稠且在原油平板上能夠生長的菌株進行復篩。取初篩菌株發酵液，對某煉廠含油廢水做絮凝實驗，測定COD和石油類去除率，將絮凝效果最好的融合菌株進行保藏。

1.6 菌體生物量的測定

取3 mL培養液，6000 r·min-1離心3 min，用0.01 mol·L-1的磷酸緩沖溶液(pH值7.0)將細胞清洗3次，最后用3 mL無菌水懸浮，以無菌水為空白對照，在600 nm下測定吸光度(OD600)。

根據走訪調研，選取5種當地具有代表性的農林復合經營模式進行深入分析評價，分別是楊樹—土雞復合經營模式(林禽復合經營模式)、楊樹—包菜—南瓜復合經營模式(林菜復合經營模式)、楊樹—麥冬復合經營模式(林藥復合經營模式)、楊樹—油菜復合經營模式(林油復合經營模式)以及純林種植模式，分別用X1，X2，X3，X4，X5表示。采取農林復合經營的楊樹人工林均為2013年3月造林，造林株行距均為5 m×6 m。

1.7 含油廢水絮凝處理

在250 mL燒杯中加入含油廢水150 mL，再加入適量微生物絮凝劑，在電子變速攪拌機上進行絮凝實驗。操作程序為：200 r·min-1攪拌3 min，60 r·min-1攪拌3 min，靜置3 min。取上層水樣50 mL，分別測定絮凝前后的COD和石油類濃度等[8，9]。以不加發酵液為空白對照計算去除率。

2 結果與討論

2.1 原生質體融合菌株篩選結果

從發酵培養基上挑取了67株融合菌株，經過初篩，選擇7株融合菌株進行復篩，結果見圖1。

圖1 融合菌株篩選結果

由圖1可知，1#融合菌株的絮凝性能最好，COD去除率、石油類去除率分別達到39.5%、68.8%。將該菌株命名為FB-1，對其進行發酵條件及絮凝條件優化，并與融合前的菌株進行絮凝性能比較。

2.2 發酵條件優化

2.2.1 發酵時間的影響

在發酵培養基中接種融合菌株FB-1，接種量為1%，于35℃、150 r·min-1振蕩培養，定時取樣進行絮凝實驗及生物量測定，計算COD與石油類去除率，結果見圖2。

圖2 發酵時間對微生物絮凝劑性能的影響

由圖2 可知，在接種融合菌株24 h后，菌株生長進入對數期，32 h后進入穩定期，44 h后進入衰亡期。由COD與石油類去除率曲線可以看出，菌株生長穩定后期絮凝效果最好。因此后續實驗的發酵時間均選擇44 h。

接種量影響細菌在培養基中的生長基數以及對營養物質的利用，適宜的接種量會使細菌達到最佳生長狀態。接種量對融合菌株所產絮凝劑性能的影響結果見圖3。

圖3 接種量對微生物絮凝劑性能的影響

由圖3可知，隨著接種量的增大，微生物絮凝劑的絮凝性能提高；當接種量為1.5%時，絮凝性能最好；繼續增大接種量，絮凝性能逐漸降低。綜合考慮，選擇融合菌株FB-1的最佳接種量為1.5%。

2.2.3 初始pH值的影響

固定菌株FB-1接種量為1.5%、發酵時間44 h，其它條件不變，考察發酵培養基的初始pH值對融合菌株所產絮凝劑性能的影響，結果見圖4。

圖4 初始pH值對微生物絮凝劑性能的影響

由圖4可知，初始pH值為7.0～8.0時，微生物絮凝劑的絮凝性能較好；pH值為8.0時，絮凝性能最佳。因此，選擇發酵培養基的最佳初始pH值為8.0。

2.2.4 裝液量的影響

裝液量會影響細菌生長過程中的通氣量及營養物質濃度等，影響細菌的生長狀態，從而影響其產生的微生物絮凝劑的性能。

在250 mL錐形瓶中分別加入發酵培養基10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL，固定菌株FB-1接種量為1.5%、初始pH值為8.0、發酵時間44 h，其它條件不變,考察裝液量對融合菌株所產絮凝劑性能的影響，結果見圖5。

圖5 培養基裝液量對微生物絮凝劑性能的影響

由圖5可知，隨著培養基裝液量的增加，微生物絮凝劑的絮凝性能逐漸提高；當裝液量為30 mL時，絮凝性能最好；繼續增加裝液量，絮凝性能降低。因此，選擇發酵培養基的最佳裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶。

2.2.5 培養溫度的影響

培養溫度影響細菌的生長代謝，從而對微生物絮凝劑的性能產生影響。溫度過低菌體生長速度變慢，溫度過高細胞內代謝途徑將發生改變。固定菌株FB-1接種量為1.5%、初始pH值為8.0、裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶、發酵時間44 h，其它條件不變，考察培養溫度對融合菌株所產絮凝劑性能的影響，結果見圖6。

圖6 培養溫度對微生物絮凝劑性能的影響

由圖6可知，30℃時,微生物絮凝劑的絮凝性能最佳；溫度過高或過低，都會降低絮凝劑的性能。因此，選擇最佳培養溫度為30°C。

2.3 遺傳穩定性及絮凝性能研究

固定菌株接種量為1.5%、初始pH值為8.0、裝液量為30 mL/250 mL錐形瓶、培養溫度為30℃、發酵時間44 h，其它條件不變，比較三代融合菌株及原始菌株所產微生物絮凝劑的絮凝性能，結果見圖7。

1#、2#、3#、4#分別為FB-1Ⅰ代、Ⅱ代、Ⅲ代及原始菌株B-6-1

由圖7可知，三代融合菌株FB-1所產微生物絮凝劑的絮凝性能基本保持穩定；與原始菌株B-6-1相比，COD和石油類去除率均有所提高，其中，FB-1Ⅲ代的石油類和COD的去除率分別為70.8%、41.2%。這表明原生質體融合技術能夠有效改善微生物絮凝劑的性能。

3 結論

篩選獲得7株融合菌株，其中，FB-1融合菌株所產絮凝劑對含油廢水的COD去除率、石油類去除率均最高，分別達到39.5%、68.8%，其絮凝性能最好；確定 FB-1的最優發酵條件為：發酵時間44 h、接種量1.5%、培養基初始pH值8.0、培養基裝液量30 mL/250 mL錐形瓶、培養溫度30℃；FB-1所產微生物絮凝劑的絮凝性能比較穩定，FB-1Ⅲ代的石油類和COD的去除率分別為70.8%、41.2%，與原始菌株B-6-1相比均有所提高，表明原生質體融合技術能夠有效改善微生物絮凝劑的性能。

參考文獻：

[1] 陳洪斌,龐小東.李建忠，等.煉油廢水的處理和回用進展[J].給水排水,2002,28(2):52-55.

[2] 李德豪,何東升,陳建軍,等.煉油污水氣浮絮凝處理的工業試驗[J].石油煉制與化工,2000,31(11):34-37.

[3] 徐美娟,易賢輝.制漿造紙廢水的微生物絮凝劑[J].紙和造紙,2003,(5):53-57.

[4] Shih I L,Van Y T,Yeh L C,et al.Production of a biopolymer flocculant fromBacilluslicheniformisand its flocculation properties[J].Bioresource Technology,2001,78(3):267-272.

[5] 王登宇，臧威，孫劍秋，等.細菌原生質體融合育種技術及其應用進展[J]．中國釀造，2008，(7)：1-6.

[6] 羅立新.細胞融合技術與應用[M ]．北京：化學工業出版社，2004：5-10.

[7] Muralidhar R V,Panda T.Fungal protoplast fusion——a revisit[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2000,22(5):429-431.

[8] 國家環保局．水和廢水監測分析方法(第四版)[M]．北京：中國環境科學出版社，2002：210-212，491-494．

[9] 李智良，張本蘭，裴健．微生物絮凝劑產生菌的篩選及相關廢水絮凝效果試驗[J]．應用與環境生物學報，1997，3(1)：67-70．