HLA-G在子癇前期患者與正常妊娠胎盤中的差異表達

王小紅,王軍青,王志君,潘小紅

子癇前期嚴重危害著孕產婦及圍產兒的健康,發病機理至今仍不明。其發病機制一直是產科研究的重要課題,母胎免疫耐受是近年來研究的熱點之一,直接暴露于母體血竇的胎盤滋養細胞表面的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)G分子在母胎局部免疫調控機制中起著極為重要的作用。為了進一步闡明 HLA-G在母胎免疫耐受中的作用機制,本文研究了正常與子癇前期患者胎盤組織中 HLA-G的表達,旨在揭示 HLA-G表達與子癇前期的發病關系,并為臨床篩查、預防及治療子癇前期提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取 2008年 1月至 2009年 1月我院分娩的 24例子癇前期患者胎盤組織為觀察組,輕度子癇前期 12例,重度子癇前期 12例,孕婦平均年齡(29.5±2.8)歲,平均孕周(37.6±1.8)周,同期分娩的正常妊娠婦女 24例胎盤組織為對照組,平均年齡(27.3±3.2)歲,平均孕周(39.3±1.1)周。兩組行均衡性檢驗,差異無統計學意義(P＞0.05),子癇前期診斷標準參照《婦產科學》[1]。

1.2 標本采集 胎盤娩出后 5min內采集近臍根部母體面胎盤組織(避開鈣化區及出血點)大小約1.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的組織,約 100 mg,用生理鹽水漂洗去除血液,干紗布吸除水分,裝入冷凍管后迅速入液氮保存,次日置 -80℃冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈技術) 按 Trizol(美國 Invitrogen公司)說明書提取胎盤組織中總的RNA,采用 SuperScriptTMOne-Step RT-PCRwith Platinum·Taq試劑盒(Invitrogen公司),紫外分光光度計測定 RNA濃度后,加入 5μg模版 mRNA進行絨毛外細胞滋養細胞 mRNA的逆轉錄和第一輪擴增。其中,上游引物設計在外顯子 1,下游引物設計在外顯子 5和 6的連接處,擴增 HLA-G mRNA。采用Platinum·Taq DNA Polymerase High Fidelity試劑盒(Invitrogen公司)進行第二輪 PCR。

1.3.2 Western blot(免疫印跡技術) 應用常規蛋白提純方法提取細胞總蛋白,分離蛋白質,經電轉印將蛋白質轉移到 polyvinylidene difluoride(PVDF)膜上,用 5%脫脂奶粉封閉。加入稀釋度為 1∶500羊抗小鼠和羊抗兔 IgG過夜,室溫孵育 1 h。洗滌后,PVDF膜用應用 SuperSignal化學發光試劑盒(美國Pierce公司)進行化學增強發光,曝光于 Kodak X膠片 15 s,顯、定影,多次洗滌后,掃描結果,用 Leica圖象分析儀測定免疫印記條帶密度 A值。

1.4 統計學處理 全部數據統計工作用 SPSS11.0統計軟件完成,進行單因素方差分析,實驗結果用±s表示,P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HLA-G在胎盤組織中的基因表達結果 半定量分析采用數字圖像分析系統,RT-PCR顯示采用本實驗中所設計的引物,在子癇前期孕婦與正常妊娠胎盤組織中均可擴增到一片段長度為 450 bp長度的擴增片段,結果顯示 HLA-G在子癇前期孕婦胎盤與正常妊娠孕婦胎盤組織中均有表達,輕度子癇前期：0.492±0.091,重度子癇前期：0.454±0.136,均明顯低于正常妊娠組：0.711±0.129(P＜0.01),輕、重度子癇前期之間比較差異無顯著性(P＞0.05)。見圖 1。

2.2 HLA-G在胎盤組織中的蛋白表達結果 Western blot顯示HLA-G在子癇前期胎盤與正常妊娠胎盤組織中均有蛋白表達,子癇前期患者胎盤組織中HLA-G蛋白印跡條帶灰度值,輕度子癇前期：0.487±0.086,重度子癇前期：0.431±0.056,均明顯低于正常妊娠組：0.612±0.103(P＜0.01),輕、重度子癇前期之間比較差異無顯著性(P＞0.05),見圖 2。

3 討 論

3.1 HLA-G與子癇前期的關系 胚胎是一種半同種異體移植物,妊娠成功有賴于胎兒-母體間的免疫平衡,而這種平衡一旦失調,即可能引發排斥反應,導致病理妊娠,子癇前期一直被認為是由于子宮胎盤灌注低下引起,可能與母體對半異體基因的胎兒發生異常的免疫應答有關[2]。同時,子癇前期患者在胎兒分娩后即自然好轉的規律也提示疾病的根源可能在于母胎間免疫應答變化。有學者認為人類白細胞抗原 G、E和 F很可能在妊娠母體接受半同種移植的胎兒中具有功能協同作用,甚至相互置換,三者中尤以 HLAG與妊娠密切相關[3]。另有學者認為 HLA-G在調節母胎免疫耐受方面具有關鍵性作用[4-5]。子癇前期生理性血管重鑄存在顯著的障礙,滋養細胞侵蝕僅達子宮螺旋動脈蛻膜段,其可能的原因是 HLA-G表達缺陷的滋養細胞易受母體免疫系統攻擊不能有效侵入母體螺旋動脈完成血管重鑄過程。HLA-G分子屬于非經典的主要組織相容性復合體(MHC)I類分子,其編碼基因位于人類 6號染色體緊鄰編碼經典人類白細胞抗原 A附近,具有有限的分子多態性、選擇性組織分布和調控母體免疫細胞的功能等特點。由于HLA-G分子的特性及功能,人們推測它可能與子癇前期的發病密切相關。Hara等[6]發現正常妊娠絨毛外細胞滋養細胞(extravillous trophoblast,EVT)均表達HLA-G蛋白,而子癇前期滋養細胞 HLA-G的表達呈孤島狀減少或缺失。Goldman等[7]應用原位雜交的方法檢測 HLA-GmRNA在正常妊娠和子癇前期胎盤的表達,發現正常妊娠 HLA-G mRNA在絨毛外細胞滋養細胞的表達沿侵入途徑逐漸升高,而在子癇前期胎盤的表達極少,缺少上述表達升高模式。Yie等[8]研究應用特異性酶聯免疫吸附法測定了正常和子癇前期患者胎盤組織及血液中 HLA-G蛋白的表達,發現血液及胎盤組織中 HLA-G蛋白的表達與發病具有相關性。子癇前期患者蛻膜局部的免疫微循環環境存在著 Th1/Th2比率失衡,HLA-G在調節 Th1/Th2細胞因子的平衡方面具有重要作用[9]。HLA-G介導的細胞因子失衡可能是子癇前期發病的重要因素[10]。以上研究表明 HLA-G可能與子癇前期的發病過程有著密切關系。但是還有研究對此提出了不同觀點,他們應用免疫組織化學方法分析了正常胎盤組織與重度子癇前期患者胎盤組織中 HLA-G的表達,發現 HLA-G的減少不僅存在于子癇前期胎盤組織,正常胎盤細胞滋養層也存在 HLA-G減少的區域,從而提出 HLA-G生成降低并不是子癇前期發病的原因,而是由于滋養層細胞壞死減少所致[11-12]。對這些文獻分析發現兩種分歧的觀點主要是由于實驗中標本的采集方法及實驗中的檢測方法造成的,因此,為了進一步闡明 HLA-G分子與子癇前期的關系,本實驗我們采用 RT-PCR法結合 Western blot技術較系統研究了HLA-G在子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦胎盤組織中在基因與蛋白表達水平,更為精確地研究了HLA-G的表達量。

3.2 HLA-G在子癇前期患者胎盤中的表達 Western blot免疫印跡方法是一種對蛋白表達進行較精確定量的方法,本研究結果顯示 HLA-G在基因與蛋白水平上均有明顯降低,尤其在蛋白表達水平 HLA-G降低更為明顯,表明子癇前期胎盤組織 HLA-G表達水平降低確實與子癇前期發生有關,輕重度子癇前期的表達水平無差異,故 HLA-G尚不能作為子癇前期病情嚴重程度的篩選指標。HLA-G蛋白在子癇前期胎盤組織內表達水平的降低達一定程度后可能不足以讓母體子宮內的免疫細胞產生免疫耐受,致使母體子宮對胎盤滋養細胞產生了免疫攻擊,一方面致使胎盤滋養細胞不能向子宮脫膜深層浸潤,產生淺著床,導致胎盤供血不足,影響胎兒的生長發育,同時母-胎界面不斷的免疫炎癥反應產生大量持續不斷的炎癥因子,導致母體全身廣泛的動脈收縮與痙攣,造成母體動脈血壓急劇升高,導致子癇前期的發生。文獻中產生的不同觀點可能與胎盤組織 HLA-G表達降低的程度有關,因為只有降低到一定程度后,才能讓母體子宮不產生免疫耐受。至于 HLA-G對滋養細胞功能尤其是調控滋養細胞對子宮蛻膜組織的黏附、浸潤影響方面尚待深入、系統研究,HLA-G表達水平可能作為臨床篩查子癇前期的指標。

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