維拉帕米對心肌細胞的保護與毒性作用

王達理,樓建英,張 偉,韓 燕,陳金安

回顧近十年文獻,維拉帕米(verapamil,Ver)細胞保護作用和細胞毒性作用一直受到關注,一方面有研究證實它可減輕缺血心肌再灌注損傷[1],另一方面又有報道它可增強抗腫瘤藥作用或直接殺傷癌細胞[2-4]。因此,Ver對心肌細胞具有保護的同時也可能存在毒性作用。本研究應用培養的心肌細胞,觀察連續培養 96 h和模擬“缺血再灌注”狀態下不同濃度Ver對細胞的影響;應用活細胞代謝染色比色分析(MTT法)測定損傷細胞釋放酶活性,評估其細胞保護與細胞毒性作用及其與藥物濃度間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 出生 1周內的 Wista大鼠由第四軍醫大學動物實驗中心提供;小牛血清由第四軍醫大學附屬唐都醫院中心實驗室提供。維拉帕米注射液(芬蘭 Orion制藥廠生產);用 Eagle(JRSUSA)干粉三蒸水配制培養基(MEM);胰蛋白酶 1∶250(Difco,USA);噻唑蘭(MTT,Sigma)用 PBS配成 2%溶液;LDH試劑盒(Beckman,USA);國產分析純試劑配制 Hang′s液和 PBS液。

1.2 心肌細胞的培養方法 Wista乳大鼠心肌剪成1.0mm ×1.0mm×1.0mm大小塊,用 0.1%胰蛋白酶消化成單個心肌細胞,經 Hang′s液清洗后再以含 20%小牛血清的 MEM充分混懸成每毫升含心肌細胞 1×106個,分別按 1m l、8 ml接種到 24孔板和培養瓶中靜置貼壁培養,每 24 h更換 1次培養基,培養 72 h后分組處理。

1.3 心肌細胞的代謝測定 分組處理后用 Hank′s液清洗心肌細胞 2次,以培養基正常培養 4 h,再以Hank's液清洗心肌細胞 2次,棄培養基后 24孔板每孔加 200μl、25ml培養瓶每瓶加 1.6ml噻唑蘭溶液,37℃靜置 4 h,棄液后加二甲基亞酚每孔 600μl、每瓶 5.0ml,振蕩顯色后測 540 nm處的吸光度值(A540)。

1.4 心肌細胞的酶活性測定 測定 A 540前取細胞培養液在 Backman自動生化分析儀上測定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)的活性。

1.5 細胞損傷與藥物保護作用

1.5.1 Ver對心肌細胞的毒性研究 培養 72h的心肌細胞 144孔分 6組,每組 24孔。正常培養組換用無血清培養基繼續培養 96 h,藥物組分別用含有 Ver 1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L無血清培養基繼續培養 96 h,每日觀察心肌細胞形態和搏動情況,最后測定乳酸脫氫酶和 A540。

1.5.2 Ver對模擬缺血再灌注損傷時心肌細胞的保護作用 將培養 72 h心肌細胞 72瓶分 6組,每組 12瓶。正常對照組換用無血清培養基,再灌注組及含 Ver 0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L組 (分別稱為 Ver A組、B組、C組、D組)換用氮氣預飽和無血清培養基后再以氮氣充滿培養瓶、旋緊瓶蓋培養 1 h,換入氧氣預飽和培養基正常培養4 h,留培養液測肌酸磷酸激酶活性;觀察心肌細胞形態和搏動情況,最后行活細胞代謝試驗測定比色值 A540。

1.6 統計學處理 采用 SPSS 15.0統計軟件,建立數據庫并對心肌細胞連續培養的毒性研究中維拉帕米各濃度組與正常對照組數據比較用配對 t檢驗;對模擬“缺血再灌注”中各藥物濃度組和正常對照組、損傷對照組的數據比較用方差分析。對活細胞 MTT法比色值與損傷細胞釋放的心肌酶活性作相關性分析;P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Ver對心肌細胞的毒性

2.1.1 Ver對心肌細胞搏動及形態的影響 在噻唑蘭代謝試驗前觀察細胞搏動,正常培養組的心肌細胞形成合胞體成片、快速(110～140次/分)、規律搏動,而未加藥物的缺氧復氧對照組的心肌細胞搏動快慢不等且不規律,部分培養瓶內心肌細胞分割成多片搏動;維拉帕米組共 48瓶心肌細胞基本維持合胞體成片搏動,較高濃度組的搏動頻率緩慢(40～ 80次 /分)。

觀察心肌細胞形態時發現 Ver 20.0mg/L以下濃度組的形態與正常培養組相近,Ver 50.0組有成片脫落現象。連續培養到 96 h,正常培養組的 24孔心肌細胞多數停止搏動;但是,Ver 1.0組全部 24孔心肌細胞都維持緩慢、成片搏動,即便是 Ver 50.0組仍觀察到多數培養孔內心肌細胞存有散在肌束搏動,噻唑蘭代謝試驗前,正常培養組全部恢復正常搏動。

2.1.2 Ver對心肌細胞的活性影響 維拉帕米對心肌細胞連續培養 96 h的毒性作用研究中,測得的乳酸脫氫酶活性與存活細胞代謝噻唑蘭比色值及其比較如表 1所示。各培養孔乳酸脫氫酶活性與 A540呈直線相關,r=-0.989(P＜0.01)。

表1 不同濃度的維拉帕米對心肌細胞的乳酸脫氫酶活性與 A540的影響(±s,n=24)

表1 不同濃度的維拉帕米對心肌細胞的乳酸脫氫酶活性與 A540的影響(±s,n=24)

注：與正常培養組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組 別 LDH(U/L) A540正常培養組 95.50±11.60 0.88±0.09 Ver 1.0 86.38±13.09* 0.94±0.10*Ver 5.0 101.48±11.99 0.84±0.10 Ver 10.0 107.50±20.45* 0.79±0.10**Ver 20.0 150.13±18.53** 0.63±0.09**Ver 50.0 337.29±43.88** 0.14±0.09**

2.2 Ver對缺血再灌注損傷時心肌細胞的保護作用 模擬缺血再灌注損傷各組,所測肌酸磷酸激酶活性與存活細胞代謝噻唑蘭的比色值及其組間數據比較結果如表 2所示。各培養瓶肌酸磷酸激酶的活性與 A540呈直線相關,r=-0.986(P＜0.01)。

表2 在心肌細胞模擬缺血再灌注損傷時維拉帕米對肌酸磷酸激酶活性與A540的影響(±s,n=12)

表2 在心肌細胞模擬缺血再灌注損傷時維拉帕米對肌酸磷酸激酶活性與A540的影響(±s,n=12)

注：與正常培養組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與Ver B組比較,##P＜0.01;與缺血再灌注對照組比較,△△P＜0.01

組別 CK(U/L) A540正常培養組 18.50±2.36△△ 0.95±0.10△△對照組 32.83±7.99** 0.45±0.09**Ver A組 23.25±5.97##*△△ 0.72±0.17##*△△Ver B組 19.25±3.57△△ 0.94±0.07△△Ver C組 19.67±5.77△△ 0.94±0.10△△Ver D組 24.08±6.32△△*## 0.74±0.15△△**##

3 討 論

維拉帕米是鈣通道阻滯劑,缺血再灌注損傷時存在鈣負荷增加,含 Ver 150μg/kg的停搏液使心臟迅速停跳,鈣蓄積降低,復跳后心功能接近正常[1]。用 0.3mg/L Ver預處理的狗心臟在缺血再灌注時線粒體谷胱苷肽及磷脂的改變明顯減輕[5]。本實驗研究發現 1.0、2.0mg/L Ver對心肌細胞沒有明顯毒性,對心肌細胞缺血再灌注損傷有明顯保護作用。然而,Ver 5.0mg/L對連續培養的心肌細胞雖然未見有不良影響,但是 0.5mg/L Ver組心肌細胞在合并有缺氧再復氧時盡管相比損傷組顯示保護作用,但相比無缺氧再復氧損傷因素的正常培養組卻有明顯受損。這提示較低濃度時的保護作用有限,較高濃度時同樣達不到理想的結果,提示與其細胞毒性有關。

在連續培養時觀察到 Ver 10.0 mg/L及更高濃度組心肌細胞明顯受損。本實驗僅觀察 Ver在不同濃度時對心肌細胞的作用,其具體的作用機制尚不能確定。不過,有報道[2-4]Ver可抑制細胞 DNA、RNA和蛋白質的合成并直接殺傷細胞。然而,活體動物的毒性還與甲狀腺功能有關,甲狀腺功能減退鼠的半數致死量差不多只有正常者的一半。對氯化鈣誘發的心律失常,以及有效的抗心律失常劑量都與甲狀腺功能有關,甲狀腺功能減退時兩者的劑量都偏小[6];毒性還涉及糖代謝[7]。這些資料也提示其毒性作用途徑較為復雜。

噻唑蘭(MTT)為一淡黃色唑氮鹽,被活細胞攝入經線粒體脫氫酶還原成紫色顆粒沉淀于細胞內或細胞周圍,二甲基亞酚溶解這些紫色顆粒,因而染色的深淺可判斷細胞存活、增殖及代謝情況[8]。紫色顆粒形成的量與細胞存活數有關,實驗中酶學檢測法研究結果與比色法結果相似,兩者間有良好的負相關關系。此外,噻唑蘭活細胞染色比色值還與細胞的代謝能力有關,保護心肌細胞時除了細胞存活以外,更重要的還要維持其正常功能。最近報道[9]心臟介入時,支架釋放后即刻于靶血管內注入維拉帕米可顯著改善冠狀動脈灌注和心肌灌注水平。這說明維拉帕米對維持心肌細胞正常功能有著重要的價值。本實驗結果中有關心肌細胞形態和細胞搏動情況,既涉及細胞存活數量更反應存活細胞的功能,雖然所觀察到的結果有著較為重要臨床意義,但是未作量化分析比較,這主要是考慮到主觀指標的統計分析價值有限,因而僅作描述,這是本實驗的不足之處。對涉及心肌細胞代謝和搏動功能,尚待完善觀察指標作深入研究。

總之,無論是外科臨床用作心臟停搏液的組成部分還是內科臨床心臟介入時用作抗心律失常、改善心肌供血[1,9],參照本實驗的結果,Ver所能達到的藥物濃度均對心肌細胞沒有直接的毒性。

[1]朱 平,程源恩,黃 立,等.異搏定加鉀停搏液對心肌保護作用的實驗研究[J].中華醫學雜志,1988,68(6)：316-318.

[2]邵寧生,金大年,張培炎,等.戊脈安對體外培養腫瘤細胞集落形成率及 DNA合成的影響[J].癌癥,1989,8(1)：39-41.

[3]劉乃豐,黃元偉,樓定安.維拉帕米抑制細胞 DNA、RNA和蛋白質合成的作用[J].浙江醫科大學學報,1990,19(3)：107.

[4]Perrotton T,Trompier D,Chang XB,et al.(R)-and(S)-verapamil differentially modulate the multidrug-resistant protein MRP1[J].JBiol Chem,2007,282(43)：31542-31548.

[5]Kajiyama K,Pauly DF,HughesH,etal.Protection by verapam il ofmitochondrial glutathione equilibrium and phospholipid changes during reperfusion of ischemic canine myocardium[J].Circ Res,1987,61(2)：301-310.

[6]Sokhanenkova AE,MIu S,EIu A,et al.Characteristics of pharmacologicaland toxic effects ofverapam ilduring cardiac arrhythmia in thyrotoxic and hypothyroid rats[J].Kardiologiia,2008,48(6)：57-61.

[7]Bechtel LK,Haverstick DM,Holstege CP.Verapamil toxicity dysregulates the phosphatidylinositol 3-kinase pathway[J].Acad Emerg Med,2008,15(4)：368-374.

[8]Ca rm ichael J,DeGraff WG,Gazdar AF,et al.Evaluation of tetrzolium based semiautomated colorimetric assay[J].Cancer Res,1987,47(4)：936-942.

[9]喬志卿,卜 軍,丁 嵩,等.冠狀動脈內應用維拉帕米對急性心肌梗死急診介入治療后冠狀動脈灌注、心肌灌注和臨床預后的影響[J].中國介入心臟病學雜志,2009,17(4)：185-190.