肺隱球菌病超微結構觀察

張 纓,李祥周,樂美兆,姜少軍,周曉軍

肺隱球菌病(pulmonary cryp tococcosis,PC)是由新型隱球菌(cryptococcus neoformans,CN)感染引起的一種非常少見的肺部真菌病,由于其臨床表現和影像學缺乏特異性,在 HE染色的切片上隱球菌孢子常著色不佳難以識別,極易漏診或誤診。本文應用光鏡和電鏡觀察 17例肺隱球菌病的組織結構和超微結構病變特征,為其臨床病理診斷提供形態學依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 1980年至 2008年,我院經病理檢查確診肺隱球菌病 17例,8例為肺穿刺活檢組織,5例為手術切除標本,2例為胸腔鏡肺活檢組織,1例為纖支鏡活檢組織,1例為胸椎穿刺活檢組織。17例中男 12例,女 5例,男女比例為 2.4∶1。患者發病年齡為 5～67歲,平均 40.2歲。3例臨床無癥狀,體檢時發現肺內病灶;余 14例均因自覺不適就診,臨床癥狀主要表現為咳嗽,咳痰,痰血,發熱,胸痛,頭痛等,少部分人亦伴有氣促,盜汗,惡心嘔吐,食欲不振,X線及 CT示肺內異常影。影像學檢查示肺部孤立性病灶 5例,肺部多發性結節 8例,兩肺彌漫性病變 4例,病灶邊緣欠清,部分可見毛刺或空洞。5例有慢性病史,1例有與飼鴿環境接觸史。入院初診僅有 1例考慮為播散性肺隱球菌病,余均誤診為肺癌、肺結核、肺膿腫或其他類型肺炎。3例并發隱球菌性腦膜炎,其中 1例合并敗血癥。

1.2 方法

1.2.1 光鏡樣品制備 送檢標本經 10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,常規切片 4μm,HE染色,同時進行過碘酸雪夫(PAS)染色,光鏡觀察。

1.2.2 透射電鏡樣品制備 17例常規石蠟包埋組織,經二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫洗二甲苯,水化后經2.5%戊二醛固定,1%鋨酸后固定,梯度乙醇及丙酮脫水,Epon-812樹脂包埋,半薄切片定位后 LKB-V超薄切片機超薄切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重電子染色,JEM1200型透射電鏡下觀察攝片。

2 結 果

2.1 肉眼觀察 5例手術切除標本,病灶大小不等,形狀不規則,邊界欠清,無包膜,切面灰白色或淡紅色半透明。實性病灶質地較韌,膠樣病灶似黏液瘤樣外觀,伴囊性變,病灶鄰近胸膜處增厚粘連;余12例均為活檢的微小組織塊。

2.2 光鏡結果 組織病理反應主要為膠質性和肉芽腫性病變兩種。膠質性病變中可見大量隱球菌,還可見其被纖維組織包裹而形成的囊腫;肉芽腫性病變主要由組織細胞、淋巴細胞、成纖維細胞及巨噬細胞組成,病變中隱球菌較少,病灶內中性粒細胞較少,周圍組織充血、水腫等炎癥反應輕微,出血、壞死及鈣化少見。在多核巨細胞和巨噬細胞胞質內及間質中隱約可見圓形或卵圓形呈空泡狀的隱球菌,HE染色呈無色或淡粉紅色,大小不一,其周圍有 3～5μm的空隙,為未著色之菌體莢膜,具有折光性。黏液卡紅染色莢膜和細胞壁呈紅色;PAS染色菌體和細胞壁呈紅色。

2.3 電鏡結果 由于組織經福爾馬林液固定后再做電鏡檢查,所以組織固定欠佳。病灶內主要細胞為巨噬細胞和多核巨細胞,細胞形狀不規則,體積巨大有突起,細胞質內有發達的線粒體、內質網和溶酶體等細胞器,部分細胞胞質內可見一至多個隱球菌孢子,部分孢子游離于細胞外(圖 1、圖 2)。隱球菌無菌絲,單細胞芽生,孢子無子囊,有寬厚的莢膜,一般比菌體大 1～3倍,中等電子密度,外周有疏電子密度微纖維,呈放射狀盤繞,莢膜與菌體之間有明顯透明帶。大部分隱球菌結構較簡單,細胞器不發達,偶可見內質網、線粒體、高爾基體、糖原和空泡等細胞器。胞體內有卵形核,為單核、有雙層核膜和清楚的核膜孔,染色質淡而均勻(圖 3、圖 4)。部分細胞發生退變,除隱約可見莢膜和菌體外,細胞器缺如,核消失,在寄生的宿主細胞內常常留下低電子密度腔隙(隱球菌噬斑)。此外,部分病例中還可見到正處于孢子生芽繁殖的菌體(圖 5、圖 6)。

2.4 隨訪資料 17例患者隨訪 15例,12例臨床治愈后無復發,3例并發隱球菌性腦膜炎,其中 2例癥狀好轉,1例合并敗血癥治療無效死亡,2例未治失訪。

3 討 論

肺隱球菌病于 1924年由 sheppe首先報道,在我國已將其與病毒性肝炎等同列為乙類傳染性疾病[1]。主要侵犯肺臟,也可累及中樞神經系統、皮膚、黏膜、骨骼及肝臟等組織。隱球菌屬于無菌絲的單細胞芽生的酵母型真菌,孢子無子囊。包括 17個種和 7個變種,其中僅新型隱球菌及其變種有致病性。CN系環境腐生菌,廣泛存在于土壤和鴿糞中,直徑一般為 5～10μm,少數為 3～20μm。菌體為寬厚透明的莢膜所包裹,莢膜可比菌體大 1～3倍。它對中樞神經系統的親和力較高,易播散侵犯腦部,一旦合并隱球菌性腦膜炎,病死率可達 20% ～30%[2-3]。肺隱球菌病的發病率不高,且好發于細胞免疫功能低下患者,如艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病、大劑量使用糖皮質激素、器官移植等患者[4]。近年來,由于免疫缺陷患者的增多及對該病認識的提高,病例報道有所增加,但臨床診斷仍很困難。

光鏡下病變類型與患者的免疫狀態以及病程有關,早期或者免疫力低下者常形成膠質性病變,晚期或者免疫力正常者常形成非干酪性肉芽腫性病變[5-6]。病理改變程度和分布范圍,與機體的反應性及菌量有相當密切的關系,且呈現出臨床癥狀和體征的顯著差異性。診斷本病的主要依據是在病變組織中查見圓形或卵圓形的隱球菌孢子。隱球菌孢子在 HE染色標本中無色或稍呈紅色,不易觀察和確認,經驗不足往往漏診或誤診。 PAS、Alcain blue、黏液卡紅等特殊染色可使菌體形態更清晰,但所有的真菌孢子這些方法都可以呈陽性反應,并且干性隱球菌在特殊染色中常著色不佳,因此不能單獨作用于隱球菌與其他真菌孢子和霉菌的鑒別。

電鏡下,隱球菌有明確的超微結構特點,菌體呈圓形或卵圓形,單細胞,無菌絲,孢子無子囊,生芽繁殖,可見清晰的莢膜及細胞壁。莢膜中等電子密度,外周有疏電子密度微纖維,呈放射狀盤繞,莢膜與菌體之間有明顯透明帶。胞體內有卵形核,線粒體嵴少、呈條索狀,可見雙層膜的內質網、糖原顆粒和大小不等的空泡,結構較簡單,可見處于生芽繁殖的菌體及隱球菌噬斑。電鏡下具有獨特的超微病理形態學特征,可反映其獨有的生物學特點,能準確的與其他真菌孢子和霉菌鑒別,具有重要的輔助石蠟切片診斷的價值。

隱球菌病的治療需根據免疫功能的不同而區別對待。對于免疫功能正常者,內科保守治療預后一般較好[7-8]。對于難治性孤立性結節患者,可實施手術治療,但有引發隱球菌性腦膜炎的傾向。尤其是免疫功能異常者,必須在術前術后給予 2周以上的系統抗真菌藥物治療,以盡可能防止隱球菌播散引發敗血癥而導致死亡。

[1]易祥華,孔 潔,朱美芳,等.原發性肺隱球菌病的病理診斷和超微結構觀察[J].中華病理學雜志,2004,33(5)：424-428.

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[4]Yang CJ,Hwang JJ,Wang T H,et al.Clinical and radiographic presentations of pulmenary cryptococcosis in immunocompetent patients[J].Scand J Infect Dis,2006,38(9)：788-793.

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[6]張 纓,宗曉福,李祥周,等.肺隱球菌病 17例臨床病理分析[J].臨床與實驗病理學雜志,2009,25(5)：485-488.

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[8]Chu HQ,Li HP,He GJ,et al.Analysis of 23 cases of pulmonary cryptococcosis[J].Chin Med J,2004,117(9)：1425-1427.