shRNA雙表達載體pCSH1的構建及抗腫瘤活性研究

何紅偉，李保衛，任開環，邵榮光

RNA 干擾（RNAi）技術是一種非常有潛力的疾病治療手段，具有干擾特異性高、可同時干擾多個基因的特點[1-3]。與化學合成小干擾 RNA（siRNA）及短發夾 RNA（shRNA）病毒表達載體法相比，shRNA 非病毒表達載體法介導的多靶點RNAi 操作簡便、成本低、干擾效果穩定且安全性高[4]。但 shRNA 表達質粒有時可以促發干擾素效應，這種非特異性作用與濃度有密切關系，在需要同時抑制兩個或多個基因時往往受到很大的限制。所以本研究設計并構建了一種可用于同時表達兩種 shRNA 的載體 pCSH1，在對兩個靶基因產生有效的特異 RNA 干擾的同時降低載體的用量，從而減少非特異性作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

質粒 pUC19，人肝癌 HepG2 細胞本室保存；pSilencer H1 3.0 購自美國 ambion 公司；TRIzol、RT-PCR 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；N-Ras、c-Myc、β-actin 單克隆抗體均購自美國 Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 可同時表達多種基因 shRNA 的載體pCSH1 的設計與構建 為了實現將兩個 shRNA轉錄單位串聯在一個載體上的目的，利用同尾酶的特性，需要在 shRNA 轉錄單位兩側選擇一對同尾酶和設計兩組多克隆位點（KSEE、HXEP），使這兩組多克隆位點與 shRNA 表達轉錄單位、pUC19的質粒序列有序組合，構建成質粒載體。根據以上設計思路，需人工合成兩對引物，每對引物對應一個多克隆位點。合成的引物序列分別為：KSEEa：5’ AAT TGG TAC CGT CGA CGA TAT CG 3’，KSEEas：3’ CCA TGG CAG CTG CTA TAG CTT AA 5’，HXEPa：5’ AGC TTC TCG AGA TAT CTG C 3’，HXEPas：3’ AGA GCT CTA TAG ACG TCG A 5’。KSEEa 和 KSEEas 可以退火形成雙鏈，雙鏈上含有 Kpn I、Sal I、EcoR V 和 EcoR I 共 4 個酶切位點；HXEPa 和 HXEPas 可以形成雙鏈，雙鏈上含有 Hind III、Xho I、EcoR V 和 Pst I 共 4 個酶切位點。這兩對引物退火形成雙鏈后，將 pUC19 質粒片段和 pSilencer H1 3.0 中的 H1 啟動子片段共 4 個片段連接起來。然后測序驗證插入片斷的正誤，構建形成 pCSH1 表達載體（圖1）。

圖1 pCSH1 質粒圖譜和 shRNA 轉錄模板示意圖（修改自 pSilencerH1 3.0，ambion）Figure 1 Small hairpin RNA template and the pCSH1 vector maps （Modified from pSilencerH1 3.0, ambion）

1.2.2 攜帶兩個 shRNA 表達單位的 pCSH1-shNM 載體的構建 首先合成兩個腫瘤相關基因N-Ras 和 c-Myc 的 shRNA 模板。N-Ras-shRNA的寡 DNA 引物序列為：5’ GAT CCG TGT GAT TTG CCA ACA AGG TTC AAG AGA CCT TGT TGG CAA ATC ACA CTT TTT TGG AAA 3’ 和 5’AGC TTT TCC AAA AAA GTG TGA TTT GCC AAC AAG GT C TCT TGA ACC TTG TTG GCA AAT CAC ACG 3’；c-Myc-siRNA 的寡 DNA 序列如下：5’ GAT CCC GGA AGA AAT TCG AGC TGC TTT CAA GAG AAG CAG CTC GAA TTTC TTC CTT TTT TGG AAA 3’ 和 5’ AGC TTT TCC AAA AAA GGA AGA AAT TCG AGC TGC TTC TCT TGA AAG CAG CTC GAA TTT CTT CCG G 3’；實驗中采用的陰性對照 mock-shRNA 序列為：5’GATCCC GGA TAG TAC GAG ATT ACA CTT CAA GAG AGT GTA ATC TCG TAC TAT CCT TTT TTG GAA A 3’ 和 5’ AGC TTT TCC AAAAAA GGA TAG TAC GAG ATT ACA CTC TCT TGA AGT GTA ATC TCG TAC TAT CCG G 3’。引物送到北京賽百盛基因技術有限公司合成。這三對引物退火形成雙鏈后，連入 pCSH1 載體中，分別構建成 pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 和 pCSH1-shMock 質粒。然后將構建好的載體 pCSH1-shNR 用 Sal I + Pst I酶切回收小片斷，再用 Xho I + Pst I 酶切載體pCSH1-shMyc 回收大片斷，由于 Sal I 和 Xho I是同尾酶，所以可以直接將兩個回收的片斷連接，即實現了兩個 shRNA 轉錄單位的串聯。構建后的載體中 Sal I 、Xho I 和 Pst I 3 個酶切位點的相對位置維持不變，可以繼續用于串聯更多的 shRNA轉錄單位（圖2）。

1.2.3 干擾序列表達質粒的轉染 提取真核轉染級的質粒，使用 LipofectamineTM2000 脂質體轉染人肝癌 HepG2 細胞，轉染后 24～36 h 進行沉默效果測定。

圖2 兩個 shRNA 轉錄單位串聯的流程圖Figure 2 Ligation flow diagram of two shRNA expression cassettes in one plasmid

1.2.4 RT-PCR 細胞轉染 24 h 后，用 TRIzol 提取總 RNA，并用紫外分光光度計測定 RNA 的濃度和質量。采用 RT-PCR 試劑盒對 mRNA 水平進行檢測。以 GAPDH 為內標進行 RT-PCR，反應完成后將產物進行瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀照相并分析結果。

1.2.5 Western Blot 細胞轉染 36 h 后，10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離各組蛋白樣品，半干轉膜儀將蛋白轉到 PVDF 膜上，然后進行 Western Blotting 檢測。

1.2.6 細胞克隆形成法 將質粒載體瞬時轉染HepG2 細胞 24 h 后，以每孔 40 個細胞的密度接種在 96 孔培養板中。培養 10 d，當出現肉眼可見的克隆時，甲醇固定 15min，Giemsa 染液染色15min。顯微鏡下計數大于 50 個細胞的克隆數。

1.2.7 細胞生長曲線法 將質粒載體轉染腫瘤細胞 24 h 后，將細胞以每孔 3000 個細胞鋪到 24 孔板中，并連續計數 6 d，以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸（或對數）作圖，繪制細胞的生長曲線。

1.3 統計學分析

各項檢測數據以±s表示，組間比較采用未配對t檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 shRNA 表達載體 pCSH1 的構建

按照實驗方法所述進行載體構建，構建成的載體委托寶生物公司測序，引物為M13±，雙向測序結果均正確，證明改造完成，其 shRNA 轉錄單位的序列中，EcoRI 與 BamHI 之間為H1 啟動子序列，BamHI 與 HindIII 之間為shRNA 模板及終止子序列，EcoRI 之前與 HindIII 之后為兩個多酶切位點。構建完成后的 pCSH1 如圖1 所示。

分別合成以 N-Ras 和 c-Myc 為靶點的干擾序列，以及不針對任何靶點的陰性對照 Mock序列，插入 pCSH1，得到質粒 pCSH1-shNR，pCSH1-shMyc 和 pCSH1-shMock，進行測序鑒定，結果表明各種 shRNA 模板序列正確。然后，按照實驗方法所述構建了能同時表達抗 N-Ras 和 c-Myc 的質粒 pCSH1-shNM（圖2）。

2.2 pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 和 pCSH1-shNM干擾效果的驗證

分別采用 RT-PCR 和 Western Blot 法測定質粒轉染人肝癌 HepG2 細胞后對靶基因的 mRNA和蛋白水平的影響。RT-PCR 結果表明，pCSH1-shNR 和 pCSH1-shNM 能夠有效降低N-Ras 基因mRNA 水平，而 pCSH1-shMock 對 N-Ras 基因mRNA 的水平沒有影響（圖3）。pCSH1-shMyc 和pCSH1-shNM 能夠有效降低 c-Myc 基因 mRNA的水平，而 pCSH1-shMock 對 c-Myc 基因 mRNA的水平沒有影響（圖4）。Western Blot 結果表明，pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 能分別抑制 HepG2細胞中 N-Ras 或 c-Myc 蛋白的表達，能同時干擾兩個基因的載體 pCSH1-shNM，則可以同時抑制N-Ras 和 c-Myc 蛋白的表達。而 pCSH1-shMock對 N-Ras 和 c-Myc 蛋白水平沒有影響，Western Blot 以 β-actin 作為上樣對照（圖5）。

圖3 pCSH1-shNR、pCSH1-shNM 降低 N-Ras 的 mRNA水平Figure 3 N-Ras mRNA level was distinctly reduced by pCSH1-shNR and pCSH1-shNM

圖4 pCSH1-shMyc、pCSH1-shNM 降低 c-Myc 的mRNA 水平Figure 4 c-Myc mRNA level was distinctly reduced by pCSH1-shMyc and pCSH1-shMyc

圖5 pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 和 pCSH1-shNM 對人肝癌 HepG2 細胞靶蛋白水平的影響Figure 5 Effects of pCSH1-shNR, pCSH1-shMyc and pCSH1-shNM on N-Ras and c-Myc proteins

2.3 載體 pCSH1-shNM 對細胞克隆形成的影響

為了考察 N-Ras 和 c-Myc 協同干擾是否對腫瘤抑制有增效作用，我們用克隆形成法來檢測pCSH1-shNM 對 HepG 2 細胞增殖的影響。結果表明（圖6），HepG2 瞬時轉染 pCSH1-shMock 后對克隆形成率也有一定的影響（與對照相比下降19%），而 pCSH1-shNR 處理后克隆形成率降低了51.1%，pCSH1-shMyc 轉染組降低了 54.0%；pCSH1-shNM 轉染組降低幅度最大，達到了70.5%，且與 pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 轉染組相比均具有統計學顯著性差異。

圖6 質粒 pCSH1-shMock、pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc和 pCSH1-shNM 對人肝癌 HepG2 細胞的克隆形成的影響Figure 6 Effects of pCSH1-shMock, pCSH1-shNR, pCSH1-shMyc and pCSH1-shNM on clony formation of HepG2 cells

2.4 應用 pCSH1 實現針對腫瘤相關基因 N-Ras同一位點的 shRNA 轉錄單位串聯

為了驗證 pCSH1 對同一 shRNA 轉錄單位進行串聯是否有意義，本研究構建了針對腫瘤相關基因 N-Ras 同一位點的 shRNA 轉錄單位串聯的載體 pCSH1-2shNR，并用生長曲線法檢驗它對細胞生長的影響。細胞生長曲線結果表明，處理 6 d 后，與未做任何轉染處理的對照相比較，pCSH1-shMock 轉染組的細胞存活率為61.6%，pCSH1-2shMock 轉染組的存活率為51.5%，pCSH1-shNR轉染組的存活率為39.7%，pCSH1-2shNR 轉染組的存活率為23.6%。以上結果提示相同質量的 pCSH1-2shNR 對細胞生長的抑制明顯強于pCSH1-shNR，而相同質量的 pCSH1-2shMock 對細胞生長的抑制略微強于 pCSH1-shMock（圖7）。

圖7 pCSH1-2shNR、pCSH1-shNR 對人肝癌 HepG2 細胞生長的影響Figure 7 The inhibitory effects of pCSH1-2shNR and pCSH1-shNR on human hepatoma HepG2 cells

3 討論

多靶點 RNA 干擾目前是一個研究的熱點，載體表達的多靶點 RNA 干擾最初由 Jazag 等[5]于2005年提出并驗證，目前發展了各種多靶點 RNA干擾載體的構建策略[6-9]。我們實驗室也開展了該領域的研究，采用 siRNAs 對兩個不同靶點進行抑制，還采用瞬時轉染 siRNA 或 RNA 干擾載體與藥物聯用進行多靶點研究，取得了很好的效果[10-12]。本研究構建的 shRNA 表達質粒 pCSH1的目的是用于治療，在設計時注意了盡量增加RNA 干擾的效率和盡量降低質粒在瞬時轉染時的非特異毒性兩個問題。

為了達到這個目的，必須考慮下列因素：①質粒大小盡量小；②shRNA 轉錄單位盡量多。根據這個思路，采用了 pUC19 的質粒基本序列；采用了 RNA 聚合酶 III 識別的 H1 啟動子；并將shRNA 轉錄單位串聯。pUC19 是一個很小的原核克隆質粒，分子量約為2.7 kb。目前用于 RNA 干擾表達載體的 RNA 聚合酶 III 識別的啟動子有人 H1 啟動子、人 U6 啟動子和鼠 U6 啟動子。人 H1 啟動子是三個中分子量最小的一個。利用同尾酶的特性將 shRNA轉錄單位串聯在一個質粒上也是一種操作簡便的方法，且不會增加過多的冗余序列。構建完成后的質粒 pCSH1 實現了最初的構想。

在完成質粒 pCSH1 的構建之后，我們對該載體的功能進行了驗證。實驗表明將 N-Ras 和c-Myc 的 shRNA 模板構建入 pCSH1 質粒后，均可以有效地實現對靶基因的表達特異性抑制；pCSH1 質粒可以有效地串聯相同的或不同的shRNA 轉錄單位，當質粒 pCSH1 串聯了不同的shRNA 轉錄單位后兩個不同靶點的抑制效果明顯。說明兩個 shRNA 轉錄單位存在于一個 pCSH1質粒上不會影響相互之間的轉錄活性。在此基礎上初步考察了 pCSH1-shNM 的抗腫瘤活性。在克隆形成率實驗中，pCSH1-shNM 比單獨抑制 N-Ras和 c-Myc 的質粒 pCSH1-shNR、pCSH1-shMyc 對細胞克隆形成的抑制均有顯著增強，說明這種聯合抑制可以取得更好的抗腫瘤活性。

最后我們考察了構建兩個相同 shRNA 轉錄單位的 pCSH1-2shNR，發現在相同的質粒用量的情況下，pCSH1-2shNR 對 HepG2 細胞增殖的影響明顯高于 pCSH1-shNR，表示在相同的抑制效率下所需質粒的用量前者低于后者。降低了質粒的用量就意味著質粒導入細胞過程中產生非特異毒性的可能性降低。說明 pCSH1 針對同一位點的shRNA 轉錄單位串聯可以增加 RNA 干擾效果或在保證相同的干擾效果的同時降低質粒的使用量。此外，還可以針對同一基因進行不同靶點的干擾，文獻[13]表明這樣可以提高對靶基因的抑制效率。

由此可以看出，文中所構建的載體 pCSH1 有如下特點：①分子量小；②能將 shRNA 轉錄單位串聯；③串聯之后能進行有效的干擾。該載體構建完成后，可以用于抗腫瘤研究中的多靶點干擾組合的研究，也可以被抗體導向的納米顆粒或脂質體攜帶，用于多種疾病如腫瘤等的基因治療研究。

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