新基因MAGE-n表位肽與人HSP70融合基因的構(gòu)建及表達純化

張秀敏，史琪琪，李增山，葉菁，王軍偉，林慧，曲萍，胡沛臻，隋延仿

腫瘤多肽疫苗因其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于制備和保存、腫瘤型別通用性強、治療費用相對較低等優(yōu)勢而成為腫瘤免疫治療的新方法。眾所周知，疫苗療效的關(guān)鍵在于其抗原，而有效的抗原遞呈是腫瘤免疫治療中不可缺少的重要環(huán)節(jié)。MAGE-n 基因是我室首次發(fā)現(xiàn)的 MAGE 家族中的新成員[1]，肝癌陽性率達 40%，該基因的表達模式與其他MAGE 基因相同，可作為腫瘤特異性免疫治療的靶分子。后續(xù)研究中，我們應(yīng)用表位預(yù)測結(jié)合免疫重建等技術(shù)篩選出一條具有特異性免疫活性的HLA-A2 限制性 CTL（cytolytic T lymphoeyte）表位 MAGE-n（159-167）QLVFGIEVV，經(jīng)免疫學(xué)實驗證實，體內(nèi)外均可有效地誘導(dǎo)特異性 CTL 的產(chǎn)生，有效殺傷腫瘤細胞[2]。文獻[3]和我們以往的工作表明，將 HSP70（heat shock protein，HSP）與腫瘤肽復(fù)合物聯(lián)合制成疫苗能夠激發(fā)抗原特異的CTL 反應(yīng)。本研究選擇 HSP70 為載體，構(gòu)建MAGE-n 表位肽與 HSP70 的融合基因，并進行表達純化。期望利用 HSP70 的分子伴侶作用加強APC（antigen presenting cell）細胞對抗原的加工遞呈，以增強其免疫原性，為構(gòu)建新型的腫瘤疫苗提供更有效的抗原奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種E.coliBL21（DE3）、原核表達載體pET-28a（+）、含 HSP70 基因全長片段的質(zhì)粒pCDNA3.1（+）/HSP70 均由本室保存；質(zhì)粒小樣快速提取試劑盒和小量 DNA 片段快速膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司；Pyrobest DNA 聚合酶、T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶購自日本 TaKaRa 公司；Ni Sepharose 6FF 親和層析填料購自美國 GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 采用 PCR 法構(gòu)建 QLVFGIEVV 與 HSP70的融合基因 根據(jù)引物設(shè)計原則以及 HSP70 基因的核苷酸序列，分別設(shè)計上游引物 Mn70-1 及下游引物 Mn70-2，在下游引物中加入 QLVFGIEVV的核苷酸序列（共 27 個堿基），并在引物兩端分別加入 Sac I、Hind III 酶切位點，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Mn70-1：5’ CCG GAG CTC ATG GCT CGT GCG GTC GGG ATC 3’；Mn70-2：5’ CGG AAG CTT TCA GAC GAC CTC TAT GCC GAA CAC TAA TTG CTT GGC CTC CCG GCC GTC 3’。此序列中方框標記處分別為Sac I、Hind III 酶切位點，劃線部分為表位肽QLVFGIEVV。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 1min，57℃退火 1min，72℃延伸150 s，循環(huán) 1 次；94℃變性 1min，67℃退火及延伸 210 s，循環(huán) 30 次，72℃延伸 7min，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pET-28a（+）/QLVFGIEVVHSP70 的構(gòu)建 用 Sac I、Hind III 雙酶切 PCR擴增的融合基因 QLVFGIEVV-HSP70 和表達載體pET-28a（+）進行瓊脂糖凝膠電泳。分別回收目的片段和表達載體，以 T4 DNA 連接酶于 16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21（DE3）。卡那平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆菌質(zhì)粒，以 Sac I和 Hind III 酶切和 DNA 序列分析鑒定陽性克隆。

1.2.3 融合基因 QLVFGIEVV-HSP70 的誘導(dǎo)表達及純化 將含 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70質(zhì)粒的E.coliBL21（DE3）接種于 2 ml LB/Kan+的培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約 0.6，加入終濃度為1mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)，不加 IPTG 者為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 取出，離心收菌，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，混勻，煮沸 5min，在離心半徑 8.4cm，12 000 r/min 條件下離心 10min，取上清經(jīng) SDS-PAGE 鑒定表達融合蛋白的菌落。

對 SDS-PAGE 鑒定有 QLVFGIEVV-HSP70融合蛋白表達的菌落進行大量（100～150 ml）擴增誘導(dǎo)，在離心半徑 8.4cm，5 000 r/min，4℃條件下離心 5min，將菌體重懸于 10 ml 細菌裂解緩沖液（50mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.5），超聲破碎，18 000×g，4℃離心 10min，取上清過 Ni Sepharose 6FF 親和層析柱，平衡液包含 40mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.4；洗脫液包含 300mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl，50mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.4。用 10%SDS-PAGE 電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 MAGE-n159-167（QLVFGIEVV）表位肽與 HSP70融合基因的構(gòu)建

以 pCDNA3.1（+）/HSP70 質(zhì)粒為模板，在下游引物的 5’ 端引入 27 個堿基的模擬表位基因，經(jīng) PCR 將 QLVFGIEVV 與 HSP70 的序列進行連接，獲得了 2.0 kb 的融合基因，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1）。

圖1 QLVFGIEVV-HSP70 融合基因 PCR 結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of QLVFGIEVV-HSP70 fusion gene PCR product

2.2 原核表達載體 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70的鑒定

pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 重組質(zhì)粒經(jīng) Sac I/Hind III 雙酶切后，從 pET-28a（+）載體上消化釋放出唯一的一條約 2.0 kb 的酶切片斷，與目的片斷大小相符（圖2）。其 cDNA 序列測定結(jié)果表明：肝癌抗原肽基因序列已連接于 HSP70的 3’ 末端，HSP70 序列與基因庫中的一致。在HSP70 的 5’ 端有起始碼，抗原肽基因序列的 3’端有終止碼，序列分析的結(jié)果與設(shè)計相符。

圖2 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Figure 2 Identification of recombinantpET-28a(+)/QLVFGIEVV-HSP70

2.3 大腸桿菌的融合蛋白表達及純化

SDS-PAGE 電泳顯示經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，重組載體 PET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 在約 71 kD處有一條高效表達的蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組載體未見此現(xiàn)象。經(jīng) Ni Sepharose 6FF 親和層析后，在分子量約為71 kD 處有 1 條純化的蛋白帶（圖3）。經(jīng) BandScan 軟件分析，目的蛋白純度為93.2%。

圖3 原核表達 QLVFGIEVV-HSP70 融合蛋白 SDSPAGE 電泳分析Figure 3 Analysis of prokaryotic expression QLVFGIEVVHSP70 by SDS-PAGE

3 討論

腫瘤抗原的研究不僅對闡明免疫應(yīng)答機制的腫瘤免疫逃避機制具有十分重要的理論意義，而且對腫瘤的發(fā)病學(xué)、診斷、治療以及疫苗制備都具有重要的應(yīng)用意義，是當今國際腫瘤免疫學(xué)研究的一個熱點，也是一個難點。目前，國內(nèi)外已經(jīng)對黑色素瘤、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤的肽疫苗進行了臨床試驗并取得了一定效果。腫瘤多肽疫苗雖具備諸多的優(yōu)勢但也因存在單獨免疫時免疫原性較弱、體內(nèi)易降解、只能激發(fā)低水平的CTL 反應(yīng)等問題而難以獲得理想的抗腫瘤效果。

有實驗證實，MAGE 蛋白及其 CTL 表位不僅能在體外有效誘導(dǎo)特異性細胞毒性 T 淋巴細胞的產(chǎn)生，而且也能在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性 CTLs 的產(chǎn)生，并使部分患者的腫瘤有所縮小或完全消退[4]。目前，已有數(shù)十個 CTL 表位被鑒定，且這些表位均可在體內(nèi)、外激發(fā)特異性 CTL 抗瘤免疫應(yīng)答，部分多肽表位已進入臨床 I 期和 II 期實驗，并取得較好的療效。其中本課題組篩選鑒定出的 MAGE-n 第159～167 位（QLVFGIEVV）為HLA-A2 分子遞呈，并可激活 CD8+ 和 CD4+ T 細胞[2]。后續(xù)的工作中我們將 MAGE-n 與 MAGE-3 的 HLA-A2限制性表位聯(lián)合應(yīng)用進行研究，證實了聯(lián)合表位肽較單個表位肽具有更強的免疫效應(yīng)[5]。CTL 表位肽疫苗抗腫瘤的機制在于用 CTL 表位肽刺激機體后，可引起抗原特異性的 CTL 細胞的克隆增殖，而 CD8+ 的 CTL 是目前認為抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞[6]，其向胞外釋放穿孔素、細胞溶解素等物質(zhì)或通過細胞表面的死亡受體等殺滅靶細胞，同時亦可分泌 IFN-γ 等細胞因子間接殺傷腫瘤細胞，為殺傷腫瘤創(chuàng)造一個良好的微環(huán)境。

雖然 MAGE 為腫瘤的免疫治療提供了良好的腫瘤特異性抗原，但是對抗原的有效加工提呈也是腫瘤免疫治療中的一個關(guān)鍵問題。HSP70 具有類似 MHC 結(jié)合抗原肽的結(jié)構(gòu)域，可作為抗原遞呈分子直接將抗原肽遞呈至細胞表面激發(fā)特異的 γδ T 細胞反應(yīng)。更為重要的是，HSP 本身無免疫原性，但所結(jié)合的多肽具有免疫原性，HSP 不具有多態(tài)性，HSP-肽復(fù)合物在同種內(nèi)的相互作用是可行的[7]。有研究者將 HSP 肽-復(fù)合物用于人的腫瘤治療，I 期臨床試驗結(jié)果表明沒有明顯的自身免疫效應(yīng)和細胞毒性，可使 50%患者的 CD8+ T 細胞增加，部分患者還有 NK 細胞擴增趨勢，顯示出了臨床應(yīng)用前景[3]。我們以往的研究結(jié)果也證實HSP70 能夠增強 MAGE3/HSP70 蛋白疫苗的CTL 效應(yīng)[8]。相比其他免疫佐劑而言，將 HSP70與腫瘤肽復(fù)合物聯(lián)合制成疫苗能夠激發(fā)抗原特異的 CTL 反應(yīng)，具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究中我們采用 PCR 方法將 MAGE-n159-167（QLVFGIEVV）的 cDNA 序列簡便、快捷地融合到 HSP70 的 3’ 末端，經(jīng)酶切鑒定及測序證實，融合基因構(gòu)建成功，抗原肽 QLVFGIEVV 與HSP70 基因的開放讀框正確，并在大腸桿菌中表達出與預(yù)期 Mr 大小一致的蛋白，該表達產(chǎn)物為肽疫苗的研制提供了實驗基礎(chǔ)。

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